陳瑞奇,曾貴榮,石鎮(zhèn)港,3,戚 麟,張妙紅,袁湘中,徐永興,王 平,張樂(lè)君*,洪 劍

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院,長(zhǎng)沙 410011; 2.湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心&新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410331; 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)沙 410208; 4.景德鎮(zhèn)市第三人民醫(yī)院,江西 景德鎮(zhèn) 333000)

腦外傷是由于機(jī)械性外力作用于頭部時(shí)發(fā)生的損傷,導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)病變,如顱內(nèi)損傷、意識(shí)障礙或者死亡,其高發(fā)生率、致傷殘率及死亡率已成為當(dāng)今社會(huì)威脅人類(lèi)生命安全的主要危險(xiǎn)因素之一[1]。 醒腦靜注射液源于安宮牛黃丸,由麝香、郁金、冰片、梔子組成,臨床用于腦脈瘀阻所致中風(fēng)昏迷,神志昏迷等。 臨床研究表明醒腦靜注射液對(duì)顱腦外傷有明顯的治療作用[2-4],但醒腦靜注射液大劑量治療顱腦損傷作用及不良反應(yīng)未見(jiàn)報(bào)道。 本研究通過(guò)建立犬腦外傷致腦損傷昏迷模型,觀(guān)察醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷昏迷的量效關(guān)系及不良反應(yīng),為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Beagle 犬42 只,普通級(jí),體重8～10 kg,購(gòu)于北京瑪斯生物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0001]。在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心普通環(huán)境中飼養(yǎng)[SYXK (湘) 2015-0016],實(shí)驗(yàn)室溫度范圍:20℃～26℃、相對(duì)濕度范圍:40%～70%、每日12 h/12 h 交替照明的飼養(yǎng)室,動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理審查編號(hào):2018015。

1.2 主要試劑與儀器

醒腦靜注射液,批號(hào):180203,規(guī)格10 mL/支,由無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司提供;0.9%氯化鈉注射液,批號(hào):20171112,湖南康源制藥有限公司產(chǎn)品;陸眠寧,批號(hào):20171221,吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品;LABOSPECT003 型自動(dòng)生化分析儀,日本日立公司產(chǎn)品;TD4 型低速離心機(jī),南京普朗公司產(chǎn)品;MRI 核磁共振,西門(mén)子公司產(chǎn)品;B203LED 型生物顯微鏡,重慶奧特光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;RM2235 型石蠟切片機(jī)、EG1150H+C 型組織包埋機(jī)、DFC 420C 型病理成像系統(tǒng),均為德國(guó)Leica 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦外傷致Beagle 犬昏迷模型的建立[5-6]

雄性Beagle 犬42 只,體重8 ～10 kg,按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、醒腦靜注射液劑量1 組(0.43 mL/kg)、劑量2 組(0.86 mL/kg)、劑量3 雙次給藥組((0.43+0.43) mL/kg)、劑量4 組(1.29 mL/kg)、劑量5 雙次給藥組((0.65+0.65)mL/kg),采用陸眠寧(0.02 mL/kg)麻醉,將麻醉犬固定在自制打擊器中,打擊器高度150 cm,打擊器重量3.8 kg,將打擊器置于150 cm 處,垂直打擊犬顱腦枕部,連續(xù)打擊4 次,建立犬外傷腦損傷昏迷模型。 造模后隨即給予不同劑量醒腦靜注射液,給藥體積10 mL/kg,隨后進(jìn)行腦部核磁共振檢測(cè),各組連續(xù)給藥14 d,末次給藥后麻醉犬,采血進(jìn)行生化檢測(cè)、取相關(guān)組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)

(1)動(dòng)物蘇醒時(shí)間測(cè)定:首次給藥結(jié)束后將放犬置于籠內(nèi),籠外采用高清攝像頭進(jìn)行監(jiān)控,記錄首次給藥后至動(dòng)物蘇醒時(shí)間,蘇醒以犬前爪翻正反射恢復(fù)作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

(2)腦部核磁共振檢測(cè):采用核磁共振檢測(cè)造模后和末次給藥后犬腦組織損傷情況。

(3)血清NSE、S-100B 含量檢測(cè):用ELISA 試劑盒于576 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)造模后及末次給藥后血清NSE、S-100B 含量。

(4)血常規(guī)、肝腎功能檢測(cè):末次給藥后取血檢測(cè)各組犬肝功能(ALT、AST、TBil)、腎功能(BUN、GRE)及血常規(guī)。

(5)組織病理學(xué)檢查:末次給藥后取犬心、肝、脾、肺、腎、腦組織枕部,10%福爾馬林固定,常規(guī)切片,HE 染色,顯微鏡下觀(guān)察組織病理學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平設(shè)定為P＜0.05,計(jì)量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)表示,用Leven’s test 方法檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性,評(píng)價(jià)時(shí)考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和生物學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷模型蘇醒時(shí)間的影響

如表1 所示,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組犬蘇醒時(shí)間明顯增加(P＜0.01)。 與模型對(duì)照組比較,醒腦靜注射液劑量1 組、劑量2 組(單次給藥)、劑量3 組(2 次給藥)犬蘇醒時(shí)間明顯減少(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.2 醒腦靜注射液對(duì)血清S100B、NSE 含量的影響

如表2 所示,與正常對(duì)照組比較,造模后各組犬血清S100B、NSE 含量明顯升高(P＜0.01);給藥結(jié)束后模型對(duì)照組犬血清S100B、NSE 含量明顯升高(P＜0.05)。 與模型對(duì)照組比較,醒腦靜劑量1 組、醒腦靜劑量2 組、醒腦靜劑量4 組血清S100B、NSE含量明顯降低(P＜0.05)。

2.3 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷模型損傷面積的影響

如表3、圖1 所示,腦組織核磁共振檢測(cè)結(jié)果表明,與正常對(duì)組比較,造模后各組腦損傷面積均明顯增加(P＜0.01),給藥14 d 后,與模型對(duì)照組比較,醒腦靜劑量1、劑量2、劑量3(2 次給藥)、劑量4、劑量5(2 次給藥)組犬腦核磁共振檢測(cè)損傷恢復(fù)面積明顯增加(P＜0.01)。

2.4 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷致昏迷模型血常規(guī)的影響

如表4 所示,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組犬血常規(guī)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯升高(P＜0.05),其余指標(biāo)無(wú)明顯差異。 與模型對(duì)照組比較,醒腦靜注射液劑量1 組、2 組犬血常規(guī)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P＜0.05);醒腦靜注射液劑量1 組犬單核細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P＜0.05);醒腦靜注射液劑量4、5 對(duì)犬血常規(guī)無(wú)明顯影響。

表1 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷模型蘇醒時(shí)間的影響( ˉx±s,n=6)Table 1 Effects of xingnaojing injection on the recovery time of beagle dogs

表2 醒腦靜注射液對(duì)血清S100B、NSE 含量的影響( ˉx±s,n=6)Table 2 Effects of xingnaojing injection on S100B and NSE in serum

表3 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷模型損傷面積的影響( ˉx±s,n=6)Table 3 Effects of xingnaojing injection on the area of traumatic brain injury in dogs

表4 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷致昏迷模型血常規(guī)的影響( ˉx±s,n=6)Table 4 Effects of xingnaojing injection on routine blood findings of dogs

圖1 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷模型損傷面積的影響Figure 1 Effects of xingnaojing injection on injury area in beagle canine model of cerebral trauma

2.5 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷致昏迷模型肝腎功能的影響

如表5 所示,與正常對(duì)照組比較,各組肝腎功能指標(biāo)(ALT、AST、TBil、BUN、CRE)未見(jiàn)明顯差異;與模型對(duì)照組比較,醒腦靜注射液各給藥組對(duì)肝腎功能指標(biāo)(ALT、AST、TBil、BUN、CRE)無(wú)明顯差異。

2.6 組織病理學(xué)檢查

末次給藥后,麻醉動(dòng)物解剖取各組動(dòng)物心、肝、脾、肺、腎、腦器官進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,光鏡下觀(guān)察。 大體觀(guān)察結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、模型對(duì)照組及各給藥組臟器未見(jiàn)明顯差異。 顯微鏡觀(guān)察結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、模型組及各給藥組臟器未見(jiàn)明顯病理改變,見(jiàn)圖2～7。

3 討論

腦外傷可致傷殘,引起腦部出血、水腫,以及神經(jīng)意識(shí)障礙,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[7]。 神經(jīng)標(biāo)志物S100B 和NSE 在腦損傷時(shí)迅速通過(guò)受損的血腦屏障進(jìn)入血清中。 NSE 主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中,當(dāng)神經(jīng)元損傷時(shí),NSE從細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入腦脊液中,通過(guò)損傷的血腦屏障進(jìn)入血液中,使血液中NSE 濃度升高[8-9]。 正常機(jī)體情況下,S100B 參與細(xì)胞增生、分化、和細(xì)胞凋亡等過(guò)程,血清中含量較少,發(fā)生腦外傷時(shí),血腦屏障被破壞,S100B 入血,使血清中S100B 含量大大增加[10]。S100B 的過(guò)度表達(dá)可能是腦損傷的代償反應(yīng)[11-12]。本研究結(jié)果顯示醒腦靜注射液能明顯降低腦損傷犬血清S100B、NSE 含量。 目前對(duì)腦損傷程度診斷方法以影像學(xué)檢查結(jié)果為主,核磁共振可以準(zhǔn)確的觀(guān)察到腦損傷部位,以及計(jì)算腦損傷面積[13]。 腦外傷在進(jìn)入穩(wěn)定期后,如果能夠及時(shí)給予患者有效的治療,便能夠最大程度修復(fù)患者的受損細(xì)胞,幫助神經(jīng)恢復(fù)正常的功能,有效改善預(yù)后,本研究結(jié)果顯示醒腦靜注射液能明顯增加腦損傷恢復(fù)程度。提示醒腦靜注射液對(duì)外傷致腦損傷有一定的改善作用。

表5 醒腦靜注射液對(duì)Beagle 犬腦外傷致昏迷模型肝腎功能的影響( ˉx±s,n=6)Table 5 Effect of xingnaojing injection on liver and kidney function in canine traumatic brain injury model

圖2 犬心臟組織病理學(xué)檢查(HE 染色,× 200)Figure 2 Histopathological examination of canine heart. HE staining

圖3 犬腦組織病理學(xué)檢查(HE 染色,× 200)Figure 3 Histopathological examination of canine brain. HE staining

圖4 犬肝臟組織病理學(xué)檢查(HE 染色,× 200)Figure 4 Histopathological examination of canine liver. HE staining

圖5 犬脾組織病理學(xué)檢查(HE 染色,× 200)Figure 5 Histological examination of spleen in dogs. HE staining

圖6 犬肺組織病理學(xué)檢查(HE 染色,× 200)Figure 6 Histopathological examination of canine lungs. HE staining

圖7 犬腎組織病理學(xué)檢查(HE 染色,× 200)Figure 7 Histopathological examination of canine kidney. HE staining

醒腦靜注射液具有開(kāi)竅醒腦,增強(qiáng)耐缺氧、保護(hù)腦損傷等作用[14],內(nèi)含有麝香、冰片、郁金、梔子等,其中麝香和冰片可以改善血腦屏障通透性,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,減輕腦水腫,同時(shí)可減少腦組織損傷[15];醒腦靜注射液可以有效降低顱內(nèi)壓,同時(shí)提高腦灌注壓,可以減少腦外傷昏迷蘇醒時(shí)間。 醒腦靜注射液可通過(guò)血腦屏障直達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此可以清除氧自由基,保護(hù)并修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞,還能夠抑制血管痙攣,改善受損腦部缺血缺氧的狀態(tài),消除水腫[16-17]。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明醒腦靜注射液能明顯減少Beagle 犬腦外傷昏迷蘇醒時(shí)間,且能明顯改善造模后腦損傷恢復(fù)面積,大劑量使用醒腦靜注射液對(duì)血常規(guī)、肝腎功能無(wú)明顯影響,且對(duì)動(dòng)物心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、等器官組織病理學(xué)無(wú)明顯影響,提示大劑量醒腦靜注射液無(wú)明顯的毒副作用。

綜上所述,醒腦靜注射液能明顯改善Beagle 犬腦外傷致昏迷和腦損傷程度,且大劑量使用無(wú)明顯的毒副作用。