劉曉晨,張社峰,王改鳳

(1.河南財(cái)政金融學(xué)院體育系,鄭州 450046; 2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,鄭州 450004;3.河南省中醫(yī)院腦病一區(qū),鄭州 450002)

在過去的50 年中,肥胖的患病率在世界范圍內(nèi)大規(guī)模增加,并且已經(jīng)成為導(dǎo)致2 型糖尿病發(fā)生的重要因素,是一項(xiàng)重大的健康挑戰(zhàn)[1]。 健康的生活方式、低卡路里攝入和增加能量消耗已經(jīng)成為當(dāng)下流行的行為干預(yù)和預(yù)防措施[2]。 姜黃素是一種天然化合物,分離自姜黃屬植物,具有抗炎、降血脂、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等多種作用,并且毒副作用較低[3-6]。 近年來,姜黃素在糖尿病的治療中的作用越來越被人們重視[1,7]。 本研究將通過使用ob/ob 糖尿病小鼠,探究有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素是否可以更好的糖尿病小鼠的胰島素抵抗和肝的一些列病理變化,并進(jìn)一步分析有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)糖尿病小鼠肝脂質(zhì)代謝的影響,闡明有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素改善糖尿病發(fā)病的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32 只ob/ob 糖尿病小鼠和8 只C57/BL6J 小鼠,體重18～20 g,雌雄各半,均為4 周齡,購(gòu)于南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK (蘇) 2015-0001],所有小鼠均飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物部,飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中,12 h/12 h 明暗交替環(huán)境,自由飲水和進(jìn)食, 符合倫理學(xué)規(guī)定, 倫理編號(hào)20180910,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

姜黃素粉,購(gòu)自Sigma 公司(BCBL0422G);胰島素ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Abcam 公司;血清TC、TG ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于南京建成生物工程研究有限公司;CPT-I 抗體購(gòu)于Abcam 公司。 血糖試紙和血糖儀購(gòu)于Roche 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將32 只ob/ob 糖尿病小鼠按不同性別,采用隨機(jī)數(shù)字表的方法隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(ON 組,n=8 只),有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)組(OA 組,n=8 只),姜黃素干預(yù)組(OC 組,n=8 只),有氧運(yùn)動(dòng)+姜黃素干預(yù)組(OAC 組,n=8 只),另外8 只C57 小鼠作為正常對(duì)照組(NC 組)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)干預(yù)方法

有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù): 小鼠每天進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練,持續(xù)8周,速度由第1 周的15 m/min 逐漸線性增加至第4周的25 m/min,自第5 周開始保持25 m/min,至第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束,每天上午8 點(diǎn)開始,訓(xùn)練15 min。

姜黃素干預(yù):姜黃素在使用前溶于生理鹽水配成懸溶液,每天上午10 點(diǎn)開始,給予姜黃素50 μg/g,持續(xù)8 周。

1.3.3 葡萄糖耐受和胰島素耐受實(shí)驗(yàn)

葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(glucose tolerance test):實(shí)驗(yàn)小鼠禁食10 h 后,給小鼠腹膜內(nèi)注射1.5 g/kg 體重的葡萄糖溶液,并在葡萄糖注射后30、60、90、120 min 后,尾靜脈取血并使用血糖儀測(cè)量血糖水平。

胰島素耐受試驗(yàn)(insulin tolerance test):實(shí)驗(yàn)小鼠禁食4 h 后,給小鼠腹膜內(nèi)注射1.5IU / kg 重組人胰島素,并在注射后30、60、90、120 min 后,尾靜脈取血并使用血糖儀測(cè)量血糖水平。

1.3.4 Western blot

肝臟組織樣品使用蛋白裂解液裂解后,取上清進(jìn)行蛋白定量,之后加上樣buffer 煮沸待用。 配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠,上樣,跑膠,轉(zhuǎn)膜,封閉,用特異性抗體檢測(cè)蛋白條帶。 CPT-I 購(gòu)于Abcam 公司,GAPDH 購(gòu)于武漢三鷹公司。

1.3.5 qPCR

使用Qiagen RNA 提取試劑盒提取肝組織RNA, Bio-Rad q-PCR 儀檢測(cè)基因表達(dá)情況。 采用兩步法PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序引物信息見表1。 Stage 1: 預(yù)變性引物,采用SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) (TaKaRa) 進(jìn)行定量PCR 擴(kuò)增,定量PCR 體系為10 μL: SYBR;mix:5 μL;cDNA 模板:200 ng, 95℃反應(yīng)30 s; Stage 2: PCR 反應(yīng)95℃,5 s, 60℃反應(yīng)34 s; Stage 3:在7500 Real Time PCR system 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增,溶解曲線顯示引物均特異, 用7500 software v2.0.1 (Applied Biosystems)進(jìn)行分析。

表1 所用qPCR 引物信息Table 1 The primers used in real-time polymerase chain reaction

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)來表示,采用SPSS 17.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,用t 檢驗(yàn)來分析兩兩計(jì)數(shù)資料比較,用重復(fù)測(cè)量方差分析方法來分析重復(fù)測(cè)量資料,獨(dú)立資料之間應(yīng)用單因素方差分析,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)ob/ob 小鼠空腹血糖和葡萄糖耐受的影響

由圖1A 可以看出,ON 組的空腹血糖水平顯著高于NC 組,經(jīng)過8 周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA 組、OC組和OAC 組相比于ON 組空腹血糖水平都明顯降低,并且OAC 組與NC 組沒有顯著性差異,已經(jīng)恢復(fù)到正常的水平。 接下來為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)干預(yù)對(duì)ob/ob 小鼠對(duì)葡糖糖的耐受性,我們進(jìn)行了葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果顯示,OA 組、OC 組和OAC組相比于ON 組都增強(qiáng)了對(duì)葡萄糖的耐受性,并且OAC 組比OA 組和OC 組對(duì)葡萄糖的耐受性更強(qiáng)(圖1B)。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)ob/ob 小鼠空腹胰島素水平及胰島素敏感性的影響

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,胰島素耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OA 組、OC 組和OAC 組相比于ON 組對(duì)胰島素更為敏感的同時(shí),OAC 組與NC 組沒有顯著性差異(圖2A),極大的改善了ob/ob 小鼠的胰島素抵抗情況。各組小鼠的空腹胰島素水平也顯示出同樣的結(jié)果(圖2B)。

2.3 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)ob/ob 小鼠肝功能的影響

由圖3 可以看出,NC 組小鼠血清中反應(yīng)肝功能的指標(biāo)膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)均低于ON組,經(jīng)過8 周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA 組、OC 組和OAC 組血清中的TC 和TG 水平均顯著低于ON 組(圖3A,3B),進(jìn)一步通過肝HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)干預(yù)明顯減輕了糖尿病小鼠肝的脂肪性病變(圖3C)。

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)ob/ob 小鼠肝纖維化的影響

圖4 中qPCR 結(jié)果顯示,ON 組肝中導(dǎo)致肝纖維化的膠原沉積相關(guān)基因的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照NC 組(圖4A ～4C)。 經(jīng)過8 周的實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA組、OC 組和OAC 組小鼠肝中膠原沉積相關(guān)基因的表達(dá)顯著低于ON 組,并且OAC 組與NC 組沒有顯著差異,恢復(fù)到正常小鼠的水平。

圖1 各組小鼠空腹葡萄糖水平和葡萄糖耐受試驗(yàn)Figure 1 Fasting glucose level and glucose tolerance test results in each group of mice

圖2 各組小鼠空腹胰島素水平和胰島素耐受試驗(yàn)Figure 2 Fasting insulin levels and insulin resistance test results in each group of mice

2.5 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)ob/ob 小鼠肝中脂肪酸合成和分解代謝的影響

圖5 中qPCR 結(jié)果顯示,肝中脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,肝中脂肪酸的合成并沒有顯著改變(圖5A,5B)。 與NC對(duì)照組相比,ON 組肝中脂肪酸β 氧化相關(guān)基因的表達(dá)顯著降低。 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA 組、OC 組和OAC 組肝中脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)明顯高于ON 組,并且OAC 組與NC 組沒有顯著差異,達(dá)到正常水評(píng)(圖5C,5D)。 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)干預(yù)促進(jìn)了小鼠肝中脂肪酸β 氧化從而改善了ob/ob 小鼠的糖尿病癥狀。

2.6 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素對(duì)ob/ob 小鼠肝CPT-I表達(dá)的影響

圖6 中Western blot 結(jié)果顯示,與正常對(duì)照NC組相比,ON 組小鼠肝中脂肪酸β 氧化中的限速酶肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(carnitine palmityl transferaseⅠ,CPT-I)表達(dá)量明顯降低。 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA 組、OC 組和OAC 組肝中乙酰CoA 羧化酶和脂肪酸合成酶含量明顯高于ON 組,并且OAC 組已經(jīng)降到與正常對(duì)照NC 組相同水平。 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)干預(yù)明顯促進(jìn)了糖尿病小鼠肝中肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ的表達(dá),從而促進(jìn)了小鼠的脂肪酸β 氧化,達(dá)到緩解糖尿病的癥狀,并且OAC 組效果最為顯著。

3 討論

近年來,糖尿病的發(fā)病逐年上升,已經(jīng)成為比肩癌癥和心腦血管疾病的慢性疾病[8-9]。 預(yù)防和治療糖尿病是一個(gè)復(fù)雜的過程,“五駕馬車”理論已經(jīng)讓大量糖尿病患者受益。 目前,糖尿病的預(yù)防和治療方面的研究主要以有氧運(yùn)動(dòng)以及長(zhǎng)期的藥物治療為主。 有氧運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體-4 的表達(dá),從而增強(qiáng)骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取并減輕胰島素抵抗[10-11]。 有氧運(yùn)動(dòng)過程中可以增強(qiáng)能量消耗,促進(jìn)機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)分解,并進(jìn)一步增加外周組織對(duì)葡萄糖的攝取和胰島素的分泌[12]。 之前的大量研究結(jié)果顯示,肌肉血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在有氧運(yùn)動(dòng)過程中可以增強(qiáng)毛細(xì)血管的再生功能,為骨骼肌提供充足的營(yíng)養(yǎng),調(diào)節(jié)機(jī)體的新陳代謝,提高線粒體數(shù)量和相關(guān)酶的活性,提高骨骼肌的耗氧量,此外還對(duì)心肺功能和心腦血管功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[13-14]。 姜黃素是提取自姜黃屬植物根莖中的一種有效成分,是一種多酚類化合物。 姜黃素同時(shí)具有2 鄰甲基化的酚和β-二酮功能基團(tuán),與機(jī)體的多種生物學(xué)功能緊密相關(guān)。 之前對(duì)姜黃素的研究大部分關(guān)注的是其在抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血脂以及免疫調(diào)節(jié)等方面。 最近幾年由于姜黃素天然毒性低、結(jié)構(gòu)清楚,以及對(duì)其藥理學(xué)研究的不斷深入,逐漸發(fā)現(xiàn)其在糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥中的調(diào)控作用。

圖3 各組小鼠肝病變情況Figure 3 Liver lesions in mice of each group

圖4 各組小鼠肝臟纖維化結(jié)果Figure 4 Results of liver fibrosis in each group of mice

圖5 各組小鼠肝脂肪酸合成和脂肪酸β 氧化情況Figure 5 Results of fatty acid β-synthesis and oxidation in the liver of each group

圖6 各組小鼠肝中CPT-I 表達(dá)量Figure 6 The expression of CPT-I in the liver of each group of mice

本研究中使用ob/ob 糖尿病小鼠為研究對(duì)象,探討有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素治療方法對(duì)糖尿病小鼠發(fā)病情況的影響。 ob/ob 糖尿病小鼠是瘦素缺失的小鼠,自出生6 周后就可表現(xiàn)出肥胖、空腹血糖升高、胰島素抵抗和脂肪肝等癥狀,是2 型糖尿病相關(guān)研究中常用的模型小鼠。 在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過8 周的干預(yù)后,糖尿病對(duì)照ON 組小鼠的空腹血糖水平明顯高于正常對(duì)照NC 組,經(jīng)過有氧運(yùn)動(dòng)或姜黃素干預(yù)后,葡萄糖耐受和胰島素耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OA組或OAC 組小鼠的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗情況明顯減輕,并且空腹血糖和空腹胰島素水平明顯低于ON 組。 有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素干預(yù)使小鼠的空腹血糖和胰島素恢復(fù)到正常水平,并且OAC 組的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗情況也和NC 組沒有明顯差異。

肝作為胰島素發(fā)揮功能的主要靶器官,在機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗時(shí)會(huì)發(fā)生脂質(zhì)代謝的紊亂,導(dǎo)致肝功能受到破壞、甚至發(fā)生脂肪肝。 我們通過ELISA檢測(cè)小鼠血清中的TC 和TG 發(fā)現(xiàn),經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,這些指標(biāo)均呈現(xiàn)不同程度的降低,并且以O(shè)AC組的下降最為明顯,幾乎達(dá)到正常對(duì)照NC 組水平。肝HE 染色的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OAC 組肝脂肪性病變的改善最為明顯。 通過q-PCR 檢測(cè)引起肝發(fā)生病變的纖維化相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA 組、OC 組和OAC 組均顯著低于ON 組,表明糖尿病小鼠的肝病變得到緩解。 有氧運(yùn)動(dòng)可以顯著降低機(jī)體的體重以及體脂含量,調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝狀態(tài)。 脂質(zhì)的代謝過程非常復(fù)雜,涉及到脂肪酸的合成和脂肪酸β 氧化等。 脂質(zhì)代謝的具體過程是組織中的脂肪酸被脂肪酶水解成甘油單酯和游離脂肪酸,進(jìn)入機(jī)體循環(huán)被吸收后,在小腸中重新合成甘油三酯,并進(jìn)一步形成乳糜微粒,最終由淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)運(yùn)送到外周組織中的過程。 研究人員發(fā)現(xiàn),經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,糖尿病小鼠肝中脂肪酸合成相關(guān)基因FAS 和SCD 的表達(dá)并沒有發(fā)生改變,ON 組、OA 組、OC 組和OAC 組均顯著高于正常對(duì)照NC 組。 但是脂肪酸β 氧化相關(guān)基因LCD 和UCP2 的表達(dá)在OA 組、OC 組和OAC 組均呈現(xiàn)不同程度的下降,OA 組、OC組顯著低于糖尿病對(duì)照NC 組,OAC 組達(dá)到正常對(duì)照組NC 組水平。 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ON 組糖尿病對(duì)照小鼠肝中脂肪酸β 氧化的限速酶CPT-I顯著低于正常對(duì)照NC 組,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,OA 組、OC 組和OAC 組小鼠肝臟中CPT-I 表達(dá)明顯上升。因此,本研究發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合姜黃素治療可以CPT-I 的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸的β 氧化,減輕由糖尿病引起的胰島素抵抗、肝纖維化和脂肪肝的一些列病理性變化,有望成為糖尿病的預(yù)防和治療的新方法。