盧 夢(mèng),王 鑫,王慧玲,魏 琳,周東月,馬林鋒,卞 男,李雪婷,宋 伍,郭 焱

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117)

乙醇依賴是一種慢性腦疾病,表現(xiàn)為強(qiáng)迫性的乙醇渴求以及在戒酒期間出現(xiàn)消極情緒狀態(tài)。 乙醇依賴的發(fā)展受遺傳因素和環(huán)境因素雙重因素影響[1]。 長(zhǎng)期攝入乙醇導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)及其受體發(fā)生適應(yīng)性變化,包括GABA 受體、谷氨酸受體、阿片類受體、5-HT3受體以及多巴胺受體等[2-10]。 細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)與藥物成癮引起的神經(jīng)適應(yīng)性、獎(jiǎng)賞效應(yīng)和覓藥行為密切相關(guān)[11]。 目前研究發(fā)現(xiàn)能夠改善乙醇成癮癥狀的藥物主要包括作用于GABA 受體、阿片受體、甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、神經(jīng)肽受體及磷酸二酯酶類的化合物[12]。

行為敏化是指反復(fù)、間斷給予成癮性藥物后,動(dòng)物對(duì)成癮性藥物的行為效應(yīng)增強(qiáng)。 反復(fù)使用精神刺激物被認(rèn)為會(huì)引發(fā)與獎(jiǎng)賞效應(yīng)相關(guān)神經(jīng)回路中持續(xù)的神經(jīng)適應(yīng)性,這些神經(jīng)適應(yīng)作用調(diào)節(jié)了行為敏感性[13]。 因此,行為敏化的獲得和表達(dá)可能反映了增加藥物依賴風(fēng)險(xiǎn)的潛在機(jī)制,也是目前評(píng)價(jià)藥物精神依賴的重要模型。

人參(Panax ginsengC. A. Mey.)作為藥物使用最早記錄在2000 多年前的《神農(nóng)本草經(jīng)》中。 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)人參含有多種活性成分,包括人參皂苷、人參多糖、脂溶性成分、氨基酸、維生素、蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)酸以及微量元素等[14]。 人參多糖(ginseng polysaccharides,GSP)具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗高血糖、中樞神經(jīng)保護(hù)作用[15-17]。 目前對(duì)人參的研究多集中在人參皂苷,但人參多糖的藥理活性不容忽視,特別是在中樞神經(jīng)的保護(hù)作用。 盡管研究證實(shí)了人參多糖的神經(jīng)保護(hù)作用,但對(duì)乙醇成癮的研究未見(jiàn)報(bào)道。 基于此,本研究通過(guò)融合雙瓶飲酒模式和行為敏化模型,評(píng)估人參多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)的行為敏化小鼠行為學(xué)變化及ERK/c-fos 通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)6 周齡雄性KM 小鼠(22±2)g,購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[SYXK(吉) 2018-0014],飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(吉)-2018-0007]。 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d,期間自由飲水進(jìn)食,飼養(yǎng)室溫度為(23±2)℃,相對(duì)濕度(50±5)%,光照時(shí)間12 h(光照)/12 h(黑暗)。本研究涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理均符合長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員委會(huì)的相關(guān)規(guī)定(審批號(hào):2018011),并在實(shí)驗(yàn)期間按照3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

人參多糖粉末由吉林省中醫(yī)中藥研究所提供,制備方法沿用實(shí)驗(yàn)室前期的方法[18]。 人參粉碎,采用水提醇沉法和Sevag 除蛋白法得到人參多糖粗提物,粗提物用2×10-3mol/L NaCl 溶解,上到已用2×10-3mol/L NaCl 平衡的DEAE-T0Y0PAERL 柱上,用上述溶劑洗脫,再用2×10-3mol/L ～2.5×10-1mol/L NaCl 梯度洗脫,得分子量為5.5×103～2.5×104的多糖部分。 無(wú)水乙醇(北京化工廠,批號(hào):20180518),多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站),OFT-100 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(成都泰盟軟件有限公司,箱底分成5×5 的格子,將中央1/4 的面積定義為中央?yún)^(qū)域),ERK 抗體(美國(guó)Abcam 公司,貨號(hào):54230),p-ERK 抗體(美國(guó)Abcam 公司,貨號(hào):192591), c-fos 抗 體(美 國(guó)Abcam 公 司, 貨 號(hào):190289),電泳槽(美國(guó)Bio-Rad 公司,Sub Cell GT),蛋白轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad 公司,mini-p4),電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司,PowerPac)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組、造模及給藥

將80 只小鼠隨機(jī)分為五組:空白組、模型組、GSP 低劑量(100 mg/kg)、GSP 中劑量(200 mg/kg)和GSP 高劑量(400 mg/kg),每只小鼠均單籠飼養(yǎng)。參照Blednov,Bahi 等[19-20]的方法并稍作修改建立行為敏化模型。 適應(yīng)期:先讓小鼠每天接受兩個(gè)都盛蒸餾水的水瓶,適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d,每天更換一次水瓶位置。 形成期:除空白組,將其中一瓶水替換為3%的乙醇,另一瓶仍用蒸餾水。 3%的乙醇喂養(yǎng)4 d后按6%,9%,12%的梯度每隔4 d 遞增乙醇濃度。每天更換乙醇和水的位置,避免形成條件位置偏好,并且每天測(cè)量乙醇和水的消耗量,計(jì)算每天乙醇(g/kg)的消耗量。 模型組和空白組每天灌胃給予生理鹽水,給藥組每天灌胃給予人參多糖溶液,并于給藥后30 min 記錄各組小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。 轉(zhuǎn)換期:第21 天將兩個(gè)水瓶都裝入蒸餾水,在第21 天上午8:00-12:00 檢測(cè)各組小鼠開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn),繼續(xù)正常飼養(yǎng)4 d。 激發(fā)期:將模型組和給藥組其中一瓶水更換為3%乙醇。 模型組和空白組灌胃給與生理鹽水,給藥組給予人參多糖溶液,30 min 后測(cè)各組小鼠自主活動(dòng),流程見(jiàn)圖1。

1.3.2 自主活動(dòng)測(cè)試

將小鼠單獨(dú)置于大鼠飼養(yǎng)籠中,用多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀記錄小鼠自主活動(dòng)次數(shù)。 在第0～4天,記錄小鼠在12 h 內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù);而在第5 ～25 天,每天給與GSP 干預(yù),在30 min 后測(cè)試12 h 內(nèi)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。

1.3.3 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Figure 1 Experimental procedures

在第21 天上午8:00-12:00 進(jìn)行開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。 先將小鼠放在空曠地區(qū)自由探索5 min,之后將小鼠放在OFT-100 開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱的中心區(qū)域,記錄小鼠站立次數(shù)和爬格數(shù)(以至少三個(gè)爪子跨入同一格子內(nèi)記為1)。 記錄5 min,每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用乙醇擦拭開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱。

1.3.4 前額葉皮層氧化應(yīng)激相關(guān)因子測(cè)定

ELSIA 法檢測(cè)前額葉皮層MDA 含量及SOD 和CAT 活力。 取前額葉皮層組織稱重并加入9 倍量生理鹽水,勻漿,3000 r/min 離心10 min,取上清,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。 采用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm 處測(cè)定并計(jì)算樣品中蛋白含量。

1.3.5 前額葉皮層ERK、p-ERK 和c-fos 蛋白表達(dá)

采用Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)。 取前額葉皮層組織并加入蛋白裂解液,勻漿,取上清液待用。測(cè)定蛋白含量后,取等量蛋白與含巰基乙醇的4×凝膠加樣緩沖液混合并煮沸10 min。 經(jīng)SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)膜(PVDF 膜),含5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗ERK(1 ∶500 稀釋),p-ERK(1 ∶500 稀釋),c-fos(1 ∶200 稀釋),4℃孵育過(guò)夜,洗膜3 次后加入二抗孵育1 h,加入ECL 顯影液顯影。 用Quality-one 軟件分析條帶灰度值。

1.3.6 Real-time PCR 檢測(cè)前額葉皮層中ERK,cfos 的mRNA 表達(dá)

按照用100 ∶1加入TRIzol 裂解,總RNA 提取按照RNeasy 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。 總RNA 濃度用ND-2000 微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 的含量,當(dāng)OD260/OD280＞1.8 時(shí), RNA 純度符合要求。 采用高容量逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,應(yīng)用Power SYBR Green Master Mix 進(jìn)行PCR 定量,反應(yīng)參數(shù)為95℃3 min,95℃10 s,60℃45 s,共40 個(gè)循環(huán)。 結(jié)果采用相對(duì)定量法進(jìn)行分析[21],用2-ΔΔCT 表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)表示,采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較運(yùn)用單因素方差分析,方差齊采用LSD檢驗(yàn),方差不齊則用Dunnett’s 檢驗(yàn),P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSP 對(duì)乙醇敏化小鼠自主活動(dòng)的影響

如表2 所示,模型組小鼠經(jīng)過(guò)自由攝取逐漸遞增劑量(3%,6%,9%,12%)的乙醇后,自主活動(dòng)在d13 后顯著性增加。 經(jīng)過(guò)4 d 不給予乙醇的轉(zhuǎn)換期,再次3%乙醇激發(fā),模型組第25 天自主活動(dòng)次數(shù)增加至(5312.11±1581.31)次,較空白組顯著升高(P＜0.05),提示乙醇誘導(dǎo)的行為敏化模型建立;與模型組比較,GSP 三個(gè)劑量組在激發(fā)期的自主活動(dòng)次數(shù)明顯降低(P＜0.05),提示GSP 抑制了乙醇引起的行為敏化表達(dá)。

2.2 GSP 對(duì)乙醇敏化小鼠乙醇攝取量的影響

如表3 所示,模型組小鼠第25 天攝取3%乙醇(1.87±0.67) mL 顯著高于空白組的(1.25±1.10)mL(P＜0.05);與模型組相比,GSP 三個(gè)劑量組乙醇攝取量較模型組明顯降低(P＜0.05),表明GSP 能夠顯著抑制成癮小鼠的乙醇攝取。

2.3 GSP 對(duì)乙醇敏化小鼠轉(zhuǎn)換期開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響

如表4 所示,與空白組比較,模型組小鼠在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的爬格數(shù)和站立次數(shù)及進(jìn)入中央次數(shù)和中央停留時(shí)間均顯著下降(P＜0.05),提示在此模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在轉(zhuǎn)換期出現(xiàn)焦慮樣行為;與模型組比較,GSP三個(gè)劑量組組開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的爬格數(shù)和站立次數(shù)顯著增加,GSP 中、高劑量組進(jìn)入中央次數(shù)及中央停留時(shí)間顯著增加(P＜0.05),表明GSP 對(duì)乙醇敏化小鼠轉(zhuǎn)換期出現(xiàn)的焦慮樣行為具有抑制作用。

2.4 GSP 對(duì)前額葉皮層MDA、SOD 及CAT 的影響

如表5 所示,與空白組比較,乙醇誘導(dǎo)的行為敏化小鼠前額葉中MDA 含量顯著升高(P＜0.05),SOD和CAT 活性顯著降低(P＜0.05),提示行為敏化模型小鼠前額葉皮層氧化應(yīng)激水平增高;與模型組比較,GSP 中、高劑量組顯著降低前額葉皮層中MDA 含量(P＜0.05),SOD 和CAT 活力顯著升高(P＜0.05),表明GSP 可能增強(qiáng)了前額葉皮層的抗氧化能力。

表2 GSP 對(duì)行為敏化小鼠自主活動(dòng)的影響( ˉx ±s)Table 2 Effects of GSP on autonomic activity in behavior-sensitive mice

表3 GSP 對(duì)行為敏化小鼠乙醇攝取量的影響( ˉx ±s)Table 3 Effects of GSP on ethanol intake in behavior-sensitive mice

表4 GSP 對(duì)行為敏化小鼠OFT 爬格數(shù)和站立次數(shù)及進(jìn)入中央次數(shù)和中央停留時(shí)間的影響( ˉx ±s)Table 4 Effects of GSP on OFT crawling and standing times, central entry times,and central residence time in behavior-sensitive mice

表5 GSP 對(duì)前額葉皮層MDA、SOD 及CAT 的影響( ˉx ±s)Table 5 Effects of GSP on MDA, SOD, and CAT levels in the prefrontal cortex

2.5 GSP 對(duì)前額葉皮層ERK、p-ERK 及c-fos 蛋白表達(dá)的影響

如圖2 所示,Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組p-ERK/ERK比值及c-fos 蛋白表達(dá)顯著高于空白組。 與模型組比較,GSP 中、高劑量組p-ERK/ERK(P＜0.05)及c-fos 表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)。 灰度分析統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表6。

2.6 GSP 對(duì)前額葉皮層組織中ERK、C-FOS 的mRNA 表達(dá)的影響

如表7 所示,實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組ERK 和C-FOS mRNA 表達(dá)顯著高于空白組(P＜0.05)。 與模型組比較,GSP 中、高劑量組ERK 和C-FOS mRNA 表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。

3 討論

多數(shù)研究認(rèn)為乙醇成癮的機(jī)制是中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的獎(jiǎng)賞作用,即長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致獎(jiǎng)賞通路結(jié)構(gòu)產(chǎn)生適應(yīng)性改變[22]。 越來(lái)越多的證據(jù)表明C-FOS/ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與濫用乙醇成癮和復(fù)飲[11]。 ERK 激活引起從細(xì)胞膜到下游靶標(biāo)的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生直接反應(yīng)或者造成渴求和復(fù)飲行為的持久適應(yīng)性。 Sanna 等[23]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期連續(xù)給予乙醇后,大鼠不同腦區(qū)p-ERK 蛋白表達(dá)均下調(diào);而在乙醇戒斷期,多數(shù)腦區(qū)的ERK 磷酸化水平升高,說(shuō)明ERK 與乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)可塑性改變有關(guān)。 Bachtell 等[24]在研究乙醇誘導(dǎo)E-W 核c-fos 表達(dá)的機(jī)制時(shí),乙醇可以顯著上調(diào)E-W 核上c-fos 的表達(dá)。 另有研究發(fā)現(xiàn),再次暴露于乙醇相關(guān)的環(huán)境,激活了大鼠基底外側(cè)和中央杏仁核中c-fos 的表達(dá),基底外側(cè)中c-fos 的表達(dá)與c-jun和ERK 的磷酸化水平升高有關(guān)[25]。

表6 GSP 對(duì)前額葉皮層ERK、p-ERK 及c-fos 蛋白表達(dá)的影響( ˉx ±s,%)Table 6 Effects of GSP on expression of ERK, p-ERK and c-fos proteins in the prefrontal cortex

表7 GSP 對(duì)肝組織中p-ERK,C-FOS 的mRNA 表達(dá)的影響( ˉx ±s)Table 7 Effect of GSP on mRNA expression of p-ERK and C-FOS in liver tissue

圖2 各組小鼠前額葉皮層p-ERK、c-fos 蛋白表達(dá)條帶圖Figure 2 Expression bands of p-ERK and c-fos proteins in the prefrontal cortex for each group of mice

人參的活性成分抗藥物成癮研究越來(lái)越受到研究者的關(guān)注,多數(shù)研究集中在人參總皂苷(ginseng total saponin,GTS)在藥物成癮方面的保護(hù)作用。 如Kim 等[26]研究發(fā)現(xiàn)GTS 能降低尼古丁引起的神經(jīng)興奮性,并抑制其誘導(dǎo)的伏隔核(NAc)和紋狀體中Fos 蛋白的表達(dá)。 相似的是,Lee 等[27]發(fā)現(xiàn)野山參水提物能通過(guò)下調(diào)NAc 中Fos 蛋白的表達(dá)和腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)中的酪氨酸羥化酶的表達(dá)抑制嗎啡誘導(dǎo)的自主活動(dòng)的增加。 此外,GTS 可以顯著降低可卡因誘導(dǎo)的NAc 多巴胺釋放增加,且對(duì)可卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)適應(yīng)性改變有保護(hù)作用[28]。 基于近年來(lái)對(duì)人參多糖的神經(jīng)保護(hù)作用研究的進(jìn)一步深入,本研究應(yīng)用兩瓶自由選擇飲酒模式建立行為敏化模型考察人參多糖對(duì)乙醇誘導(dǎo)的行為敏化小鼠行為學(xué)變化的影響和可能的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GSP 連續(xù)給藥對(duì)乙醇誘導(dǎo)的小鼠行為敏化和乙醇攝取有顯著的抑制作用,并緩解了乙醇戒斷期引起的焦慮相關(guān)行為。 長(zhǎng)期攝取乙醇可導(dǎo)致中樞氧化應(yīng)激的增加,堆積的大量活性氧可經(jīng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程激活ERK 的磷酸化和c-fos 表達(dá)上調(diào),從而參與乙醇成癮的神經(jīng)適應(yīng)性改變。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GSP 可顯著減少前額葉皮層脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 的產(chǎn)生,并提高了抗氧化系統(tǒng)SOD 和CAT的活性。 與前期人參皂苷的研究結(jié)果相似,本研究也發(fā)現(xiàn)人參多糖能夠下調(diào)了前額葉皮層c-fos 和ERK 蛋白和mRNA 的表達(dá)。

目前,對(duì)多糖的吸收問(wèn)題仍然存在爭(zhēng)議。 雖然有文獻(xiàn)報(bào)道多糖可以被吸收, 但是尚缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[29]。 越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)中藥中的多糖類成分具有調(diào)節(jié)腸道菌群,維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)的作用[30]。 Zhou 等[31]研究發(fā)現(xiàn),人參多糖有助于修復(fù)腸道微生物的整體環(huán)境,促進(jìn)人參皂苷的腸道生物轉(zhuǎn)化。 此外,有研究發(fā)現(xiàn)慢性酒精攝取能夠引起人和嚙齒動(dòng)物腸道內(nèi)抗炎細(xì)菌普氏棲糞桿菌和雙歧桿菌的水平降低以及革蘭氏陰性的變形菌門的細(xì)菌豐度增加[32]。 通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群可能通過(guò)恢復(fù)腸道屏障功能、減少全身炎癥對(duì)治療酒精依賴和減少酒癮復(fù)發(fā)產(chǎn)生有益作用。 綜上所述,我們推測(cè)人參多糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群,發(fā)揮抗氧化活性抑制p-ERK/c-fos 通路改善乙醇誘導(dǎo)的行為敏化和乙醇消耗。 本研究結(jié)果為今后繼續(xù)探究人參多糖的神經(jīng)藥理活性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為乙醇成癮提供新的治療藥物。