仲鑫汝,許 龍,田 睿,蘇 靜,張 勇

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,長(zhǎng)春 130000)

肝癌是一種以高發(fā)生率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率為特征的侵襲性惡性腫瘤。 在全球范圍內(nèi),每年診斷出超過(guò)70 萬(wàn)例肝癌患者,大多數(shù)國(guó)家死亡率幾乎等于發(fā)病率[1]。 2015 年全國(guó)腫瘤登記中心數(shù)據(jù)表明,肝癌發(fā)病率呈緩慢下降趨勢(shì),然而,肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高,導(dǎo)致預(yù)后較差,肝癌的5 年發(fā)病率僅為10.1%,是所有惡性腫瘤中最低的[2-3]。 研究表明,肝癌的主要危險(xiǎn)因素包括乙型以及丙型肝炎病毒感染、黃曲霉素?cái)z入、酒精性肝硬化、以及非酒精性脂肪肝等。 肝癌發(fā)病隱匿初始癥狀不明顯,初診時(shí)只有不到一半的患者處于早期階段,這些患者可通過(guò)手術(shù)治療(肝切除、肝移植)、TACE、化療和放療等手段治療,其中肝移植是最為有效的治療策略。然而大部分患者確診時(shí)已經(jīng)達(dá)到肝癌中晚期階段,由于肝負(fù)擔(dān)過(guò)重等原因,其中的70%患者并不適合手術(shù)治療,導(dǎo)致肝癌死亡率居高不下[4-5]。 肝癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟的病理過(guò)程,其特征是從慢性肝損傷到肝炎,肝纖維和肝硬化的過(guò)程逐漸演變,最終表現(xiàn)為肝癌,然而到目前為止,肝癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[6]。 為了探索肝癌的發(fā)生機(jī)制,尋找有效的治療方法,建立能夠精準(zhǔn)模擬人類肝癌發(fā)展進(jìn)程的動(dòng)物模型就顯得十分必要。

肝癌小鼠模型目前主要分為四種(1)自發(fā)性、(2)移植性、(3)化學(xué)性、(4)轉(zhuǎn)基因性肝癌模型,四種模型中化學(xué)誘發(fā)性肝癌模型因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單,成瘤率高等原因應(yīng)用較為廣泛,其中又以DEN 聯(lián)合CCl4最為常用。 60 年代以來(lái),遺傳毒性藥物DEN 被廣泛用于肝癌小鼠模型的建立,DEN 作為DNA 烷化劑,可破壞生物體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、并且對(duì)肝臟的親和力較高,可導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡,這一過(guò)程與肝癌的發(fā)生發(fā)展十分相似[7]。 近年來(lái)發(fā)現(xiàn),DEN(肝癌誘發(fā)劑)與CCl4(肝癌促進(jìn)劑)聯(lián)用,可加快肝癌發(fā)展,縮短造模時(shí)間,降低小鼠的死亡率,提高造模成功率,為后續(xù)研究肝癌發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[8]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠110 只,8 周齡,體重為(20±2) g,購(gòu)于北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2017-0033];實(shí)驗(yàn)于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK (吉) 2018-0001]IVC 獨(dú)立送風(fēng)隔離系統(tǒng)設(shè)施中進(jìn)行;室內(nèi)溫度為20℃～28℃,相對(duì)濕度50%～70%,噪音低于60 dB,光照明暗交替12 h/d;小鼠所食用飼料為吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心所提供高壓飼料,飲用水為滅菌蒸餾水,使用的籠子等用具均高壓滅菌處理。 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遵循3R 原則(替代、減少、和優(yōu)化),盡量用無(wú)知覺材料替代活體動(dòng)物、試圖用最少的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解決實(shí)驗(yàn)問(wèn)題并減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所承受的痛苦,給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN,美國(guó)sigma 公司,25 mL/瓶,密度為0.95 g/mL);四氯化碳(CCl4,上海凌峰凌峰化學(xué)試劑有限公司,中國(guó));ALT、AST 含量試劑盒(南京建成公司,中國(guó))。 -80℃冰箱(SANYO 公司,日本);天平(METTLER Toledo 公司,瑞士);超速低溫離心機(jī)(Beckman 公司,美國(guó)); 石蠟切片機(jī)(Leica 公司,德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制作方法

根據(jù)文獻(xiàn)[9-12]110 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠,預(yù)飼養(yǎng)7 d 適應(yīng)環(huán)境后,隨機(jī)取30 只小鼠作為正常對(duì)照組,其余80 只作為對(duì)照組。 正常對(duì)照組小鼠無(wú)處理,模型組小鼠,腹腔注射DEN(100 mg/kg),間隔2 周,再次注射DEN(50 mg/kg);第一次注射DEN 3 天后給予小鼠CCl4和橄欖油混合液灌胃處理(配置體積比為20 ∶80,劑量為5 mL/kg),每周灌胃2 次,持續(xù)進(jìn)行4 周,灌胃時(shí)動(dòng)作輕柔,以防損傷小鼠食道。

觀察對(duì)照組和模型組小鼠生長(zhǎng)狀況、精神食欲以及體重等改變情況;按照上述方法造模,分別于給藥后第4、8、12、16、20、24、28、32 周取兩組小鼠的肝組織與眼周靜脈血,對(duì)照組每次處死3 只,模型組每次處死6 只。 解剖取小鼠肝左葉,取出的肝組織一部分迅速放入4%多聚甲醛中,組織蛋白質(zhì)變性凝固,用于組織病理切片,剩余組織放入-80℃和液氮中保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);從眼眶靜脈中取靜脈血1.5 mL,靜置24 h,低溫超速離心機(jī)以4500 r/min速度(4℃)離心10 min,吸取上清,用于檢測(cè)小鼠肝中AST、ALT 含量的變化。

1.3.2 解剖形態(tài)觀察和病理學(xué)組織觀察

將肝組織從4%多聚甲醛中取出,經(jīng)過(guò)酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋等操作后,將組織切成薄片,黏附于玻片上,蘇木精-伊紅染色后,鏡下觀察小鼠病理組織學(xué)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 該實(shí)驗(yàn)所用的圖由使用GraphPad Prism version 6.02 繪制。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重變化

110 只小鼠造模前體重為(20±2)g。 與對(duì)照組小鼠比較,給藥結(jié)束后,模型組小鼠體重明顯下降;隨后的兩個(gè)月中,模型組小鼠體重逐漸回升至略低于對(duì)照組的水平,隨后的5 個(gè)月,模型組體重保持穩(wěn)定,但始終低于對(duì)照組(圖1)。

2.2 小鼠肝臟形態(tài)及病理組織學(xué)變化

小鼠解剖后,肉眼觀察小鼠肝形態(tài)。 對(duì)照組小鼠肝質(zhì)地柔軟,顏色鮮紅,肝表面光滑,未見任何病變。 模型組小鼠給藥8 周時(shí),小鼠肝表面粗糙、色澤暗淡、出現(xiàn)多個(gè)大小不一的圓形隆起;第16 周,圓形隆起增多;第24 周,肉眼可見明顯的炎性腫塊和白色腫瘤組織;第32 周,肝布滿白色腫瘤組織,肝組織正常形態(tài)基本消失(圖2)。

2.3 病理組織學(xué)結(jié)果

第6 個(gè)月時(shí)取對(duì)照組和模型組的肝左葉組織,進(jìn)行HE 染色,隨后在光鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)與正常的肝組織相比,模型組的炎性腫塊和白色腫瘤組織部位有明顯的癌癥組織病理改變(圖3)。

圖1 對(duì)照組和模型組小鼠8 個(gè)月體重變化Figure 1 Weight change of the control group and the model group at 8 months

圖2 不同時(shí)期小鼠肝臟形態(tài)Figure 2 Liver morphology of mice at different times

圖3 小鼠肝組織的病理學(xué)改變(HE 染色)Figure 3 Pathological changes of liver tissue in mice. HE staining

2.4 小鼠肝組織中相關(guān)酶的變化情況

模型組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶相比于正常對(duì)照組顯著升高,說(shuō)明模型組小鼠肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷(圖4)。

3 討論

2013 年,WHO 宣布由于肝癌導(dǎo)致死亡的人群中50%患者來(lái)自中國(guó)[13-14]。 由于死亡人數(shù)巨大,所以實(shí)現(xiàn)肝癌的早期防治,尋找有效且精準(zhǔn)的治療迫在眉睫,我們?yōu)榱擞^察肝癌的發(fā)生發(fā)展的過(guò)程,探索肝癌的發(fā)生機(jī)制,建立能夠精確模擬人類肝癌發(fā)展進(jìn)程的動(dòng)物模型就成了必要的手段。

目前應(yīng)用較為廣泛的小鼠模型主要有四種,自發(fā)性、化學(xué)性、移植性、轉(zhuǎn)基因性肝癌模型[15-16],自發(fā)性肝癌模型是小鼠在未經(jīng)過(guò)任何人工處理下自發(fā)形成肝癌,可排除人為因素的干擾,但缺點(diǎn)是造模周期長(zhǎng),成瘤率不穩(wěn)定,難以監(jiān)測(cè)[17]。 轉(zhuǎn)基因性肝癌模型是應(yīng)用基因工程把外源基因?qū)氲叫∈蠡蚪M內(nèi),不但可以從組織器官水平研究,還可以深入到細(xì)胞和分子水平,但是造模技術(shù)要求高,價(jià)格昂貴,且作用比較局限,國(guó)內(nèi)目前較少開展[18]。移植性肝癌模型是將其他動(dòng)物或人的組織或細(xì)胞移植到造模小鼠體內(nèi),該模型在臨床應(yīng)用較多,主要用于抗癌藥物篩選。 化學(xué)誘導(dǎo)肝癌模型是通過(guò)注射或者經(jīng)口給藥方式予以小鼠化學(xué)品,目前有多種誘癌劑,如二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)、黃曲霉素B1(AflatoxinB1, AFB1)、二甲基氨基偶氮苯(p-dimethylaminoazobenzene,DAB)、 亞氨基偶氮甲苯(o-aminoazotoluene, OAAT)等,肝癌的的發(fā)生是一個(gè)多步驟的病理過(guò)程,其特征是沿著慢性肝損傷到肝炎,肝纖維和肝硬化的過(guò)程逐漸演變,臨床病例中70%的肝癌患者與肝硬化有關(guān),肝硬化是肝癌患者中能觀察到的最常見的組織病理學(xué)特征,然而,絕大多數(shù)小鼠模型在誘癌過(guò)程中并未出現(xiàn)肝硬化和肝纖維化,這與人類肝癌的發(fā)生過(guò)程形成鮮明的對(duì)比,研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘癌劑二乙基亞硝胺聯(lián)合四氯化碳誘發(fā)的肝癌遵循肝炎-纖維化-肝癌過(guò)程[19-20],比較基因組學(xué)表明,二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌小鼠的基因表達(dá)與人類肝癌基因表達(dá)最為相似,DEN 誘導(dǎo)的肝癌小鼠模型便于觀察肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

在該實(shí)驗(yàn)中,我們將谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)作為評(píng)價(jià)肝損傷的指標(biāo),ALT 和AST存在于各種細(xì)胞中,但肝細(xì)胞含量最多,當(dāng)肝細(xì)胞損害時(shí), ALT 和AST 大量入血,導(dǎo)致血清中AST 和ALT 水平升高[21]。 從圖4 和圖5 中我們可以看出,與對(duì)照組小鼠相比,從第8 周開始,ALT、AST 水平逐漸升高,說(shuō)明小鼠肝細(xì)胞持續(xù)損傷,并且伴隨著ALT、AST 水平的升高,肝組織中炎性腫塊和白色結(jié)節(jié)增多,肝組織正常形態(tài)逐漸消失,最終發(fā)展成肝癌。

本實(shí)驗(yàn)中二乙基亞硝胺聯(lián)合四氯化碳雖然成功誘發(fā)C57BL/6 小鼠肝癌,但是這個(gè)模型仍然存在一些問(wèn)題,一是雖然采用各種方法來(lái)加速肝癌的發(fā)生,但形成腫瘤的周期仍然很長(zhǎng)。 二是肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不明確,尚需進(jìn)一步探索。

圖4 模型組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化情況Figure 4 Changes of ALT and AST in mice in the model group