張子龍,劉思含,姚繼紅,周俊俊

(大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧 大連 116044)

帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是繼阿爾茨海默病后第二常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,是由中腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元變性導(dǎo)致的多巴胺(Dopamin,DA)神經(jīng)遞質(zhì)缺失引起的一種普遍性運(yùn)動(dòng)障礙[1]。 隨著PD 的進(jìn)展,PD 患者的步態(tài)變異性和姿勢(shì)不穩(wěn)定性顯著呈現(xiàn)[2],節(jié)律性行走時(shí)會(huì)受到短步長(zhǎng)和低速度的阻礙,這些都與多巴胺水平的降低密切相關(guān)[3]。 常見的帕金森病癥狀包括靜置性震顫,運(yùn)動(dòng)遲緩、僵硬,失去姿勢(shì)反射等[4],其中步態(tài)紊亂是帕金森病最常見的運(yùn)動(dòng)問題之一。 患有PD 的患者通常表現(xiàn)出彎腰姿勢(shì)和步態(tài)改變、步幅長(zhǎng)度和總體速度減少、雙肢支撐增加、在擺動(dòng)階段足部間隙減小,以及節(jié)奏變快導(dǎo)致跌倒的可能性增大[5]。 漸進(jìn)性步態(tài)障礙與姿勢(shì)不穩(wěn)定最終往往剝奪了患者的運(yùn)動(dòng)能力和日常生活能力[6]。

近年來,為了彌補(bǔ)藥物誘導(dǎo)的行為學(xué)測(cè)試方法存在的種種缺陷,滿足日益增長(zhǎng)的基礎(chǔ)研究需求,諸多非藥物誘導(dǎo)的行為學(xué)測(cè)試方法相繼被應(yīng)用于PD 模型的測(cè)試與評(píng)價(jià)[7]。 其中步態(tài)分析方法已然成為研究PD 嚴(yán)重程度的重要方法[8]。 常用的步態(tài)分析方法包括:評(píng)估步行速度、擺動(dòng)和站立時(shí)間的跑步機(jī)運(yùn)動(dòng)測(cè)試[9];評(píng)估前肢使用不對(duì)稱性的氣瓶測(cè)試和評(píng)估運(yùn)動(dòng)起始狀態(tài)的前肢運(yùn)動(dòng)不能測(cè)試[10-11];此外,還有曠場(chǎng)測(cè)試[12-13]、旋轉(zhuǎn)測(cè)試[14-15]、游泳測(cè)試[16]和筑巢測(cè)試[17]等。 然而,這些測(cè)試只能單一測(cè)量步態(tài)的動(dòng)態(tài)或靜態(tài)變化,可觀察到的變化通常較弱。 而且這些測(cè)試的指標(biāo)大多應(yīng)用于單側(cè)損傷的動(dòng)物,因此不足以證明雙側(cè)受傷動(dòng)物模型的功能缺陷。 而CatWalk 計(jì)算機(jī)輔助步態(tài)分析系統(tǒng)提供了一種評(píng)估步態(tài)功能的自動(dòng)方法,它可以同時(shí)測(cè)量大量的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)步態(tài)參數(shù)[18],并且可以檢測(cè)出對(duì)于嚙齒動(dòng)物研究特別有價(jià)值的肢間協(xié)調(diào)的空間指標(biāo)與時(shí)間指標(biāo)。 本研究中我們應(yīng)用CatWalk 步態(tài)分析儀來驗(yàn)證和評(píng)估MPTP 誘導(dǎo)的雙側(cè)病變PD小鼠模型的步態(tài)變異性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8 周齡雄性C57BL/6 J 小鼠,20 只,SPF 級(jí),體重22 ～25 g,由大連醫(yī)科大學(xué)SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證:SCXK (遼) 2013-0003;使用許可證:SYXK (遼) 2013-0006]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)大連醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意,并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用中嚴(yán)格遵守“減少、替代和優(yōu)化”3R 原則給予人道關(guān)懷。 飼養(yǎng)條件:溫度21℃～23℃,相對(duì)濕度30%～60%,12 h 照明/黑暗交替的環(huán)境。

1.2 主要試劑與儀器

MPTP,購自美國sigma 公司;CatWalk 小動(dòng)物步態(tài)分析儀:CatWalk XT,Noldus,荷蘭。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MPTP 誘導(dǎo)小鼠PD 模型建立

PD 造模方法:將雄性C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為:空白對(duì)照組、MPTP 模型組。 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,每只腹腔注射給予MPTP 30 mg/kg,連續(xù)5 d?？瞻捉M給予相應(yīng)體積的生理鹽水。

1.3.2 動(dòng)物一般情況監(jiān)測(cè)

實(shí)驗(yàn)期間,每天觀察動(dòng)物一般情況:包括進(jìn)食、體重等變化。

1.3.3 步態(tài)分析實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)用來評(píng)價(jià)小鼠的自然運(yùn)動(dòng)行為及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。 采用小動(dòng)物步態(tài)分析儀(CatWalk XT,Noldus,荷蘭)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練3 d。 檢測(cè)時(shí)使小鼠自由穿過設(shè)定長(zhǎng)度的檢測(cè)通道,利用內(nèi)光源腳印折射技術(shù)對(duì)攝像頭拍攝視頻中的足印進(jìn)行高效的計(jì)算機(jī)處理,在自然行走情況下評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)情況。此過程全部在暗室環(huán)境內(nèi)完成,每只小鼠至少接受三次檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0 軟件(SPSS Inc.,Chicago,USA)分析數(shù)據(jù)。 所有數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( ˉx ±s)。 兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。 P＜0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CatWalk 采集小鼠步態(tài)圖形變化

為了評(píng)價(jià)MPTP 誘導(dǎo)PD 模型損傷后小鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性變化,我們應(yīng)用CatWalk 系統(tǒng)檢測(cè)了小鼠步態(tài)變化,捕獲大量代表性動(dòng)態(tài)視頻和圖片(圖1)。從圖中我們可以看出,空白對(duì)照組小鼠腳步以交替型為主,且步幅大小均一、步數(shù)穩(wěn)定;MPTP 模型組小鼠腳步模式混亂、步態(tài)紊亂異常、步幅大小不一,三點(diǎn)支撐的增加明顯。

2.2 CatWalk 步態(tài)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn):模型組與空白對(duì)照組相比,通過某特定距離的時(shí)間(run duration)、最大速率變化(maximum variation)、支撐相時(shí)間(stance)、腳步周期(step cycle)顯著增加,平均速度(average speed)、單位時(shí)間腳步數(shù)(cadence)、 擺動(dòng)速度(swing speed)、步幅(stride length)顯著降低(圖2、圖3)。上述8 項(xiàng)指標(biāo)變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 小鼠步態(tài)變化對(duì)比結(jié)果Figure 1 Comparison of gait changes in mice

圖2 PD 小鼠定量性速度相關(guān)指標(biāo)變化Figure 2 Changes in quantitative speed-related indicators of PD mice

圖3 PD 小鼠定量性爪印指標(biāo)變化Figure 3 Changes in quantitative paw print indicators of PD mice

3 討論

為了對(duì)MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠進(jìn)行更為直觀且無創(chuàng)的行為學(xué)評(píng)估,在本實(shí)驗(yàn)過程中引入了CatWalk 動(dòng)物步態(tài)分析技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,和空白對(duì)照組相比,MPTP 誘導(dǎo)的模型組小鼠運(yùn)動(dòng)遲緩、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力顯著下降,表現(xiàn)為通過某特定距離的時(shí)間(run duration)、 最大速率變化(maximum variation)、支撐相時(shí)間(stance)、腳步周期(step cycle)顯著增加,平均速度(average speed)、單位時(shí)間腳步數(shù)(cadence)、擺動(dòng)速度(swing speed)、步幅(stride length)顯著降低。 以上結(jié)果表明,CatWalk動(dòng)物步態(tài)分析技術(shù)能夠敏銳地捕捉到PD 小鼠的步態(tài)平衡障礙和肢內(nèi)協(xié)調(diào)缺陷。

行動(dòng)遲緩是PD 的主要行為學(xué)標(biāo)志之一,擺動(dòng)速度、步幅、腳步周期等都是與移動(dòng)性分析相關(guān)的參數(shù)。 PD 小鼠模型的步幅和擺動(dòng)速度明顯降低,可能是由于MPTP 作用誘導(dǎo)小鼠肌肉僵硬和運(yùn)動(dòng)功能減退所導(dǎo)致的結(jié)果,這與PD 患者的癥狀基本一致[19],小鼠腳步周期的增大主要是由于爪和玻璃板之間的接觸較長(zhǎng),該參數(shù)的變化也同樣與雙側(cè)6-OHDA 大鼠模型的步態(tài)評(píng)估結(jié)果相吻合[20]。 而PD模型小鼠在單位時(shí)間腳步數(shù)明顯減少,則是由于小鼠步幅的減少并不能抵消步行周期的增大所致。同時(shí),MPTP 誘導(dǎo)損傷后,還表現(xiàn)出擺動(dòng)速度降低和支撐相時(shí)間的延長(zhǎng)。 這些指標(biāo)變化進(jìn)一步說明了Catwalk 步態(tài)分析參數(shù)可反映PD 小鼠出現(xiàn)步態(tài)紊亂和步態(tài)平衡障礙。

在本項(xiàng)研究中,CatWalk 提供了對(duì)MPTP 模型小鼠在運(yùn)動(dòng)方面實(shí)時(shí)、精密且全面的分析,揭示了MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠模型的步態(tài)變化。 相比于其他常用PD 模型檢測(cè)方法,如自主活動(dòng)儀、滾筒法等,CatWalk 的使用更為便捷、檢測(cè)數(shù)據(jù)更為可靠、對(duì)小鼠的訓(xùn)練更為簡(jiǎn)單、且不會(huì)對(duì)模型小鼠造成任何損傷。 更重要的一點(diǎn)在于CatWalk 系統(tǒng)可以同時(shí)、全面地測(cè)量步態(tài)的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)相關(guān)參數(shù),并且參數(shù)與PD 行為學(xué)變化有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 在以PD 為代表的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病動(dòng)物模型的相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)中,CatWalk 檢測(cè)系統(tǒng)以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì),應(yīng)用將會(huì)越來越廣。