靳東升，張 強(qiáng)，張變?nèi)A,2，郜春花，李建華，盧晉晶

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030031；2. 忻州師范學(xué)院，山西 忻州 034000)

土壤真菌是土壤微生物的主要組成部分，對土壤礦物質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)與能量流動(dòng)具有重要的作用[1]，其多樣性既是評價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡的重要指標(biāo)[2-3]，也是評價(jià)土壤肥力高低的敏感性指標(biāo)，影響著地上植物的生長、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)及土壤健康[4-5]。真菌對環(huán)境具有敏感性[6]，有研究發(fā)現(xiàn)，土壤真菌多樣性與生境如土壤條件(溫度、濕度、容重、土壤養(yǎng)分、pH值等)、植物種類、耕作方式等密切相關(guān)。Yang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，影響我國黃土高原土壤真菌多樣性的關(guān)鍵因素是土壤有機(jī)碳和植物豐富度，而影響青藏高原天然草地土壤真菌多樣性的主要因子是植物多樣性[8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在可耕地土壤中，真菌群落結(jié)構(gòu)受到有效磷、有機(jī)碳和容重的顯著影響。丁建莉[10]研究發(fā)現(xiàn)，黑土中速效鉀、硝態(tài)氮和速效磷是改變黑土土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在采用免耕的系統(tǒng)中，真菌多樣性增加。Dong等[12]研究發(fā)現(xiàn)，真菌多樣性無變化?？梢?，不同的土壤條件、土地利用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間、氣候條件、植物覆蓋或其他因素均可能造成土壤真菌多樣性的差異。

礦區(qū)復(fù)墾土壤通常具有土壤有機(jī)質(zhì)含量低、團(tuán)聚體少、微生物活性差的特征[13-15]，已有眾多學(xué)者對不同植物種植下礦區(qū)復(fù)墾土壤理化特性、微生物區(qū)系進(jìn)行了研究。金志南等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在礦區(qū)種植豆科綠肥牧草相較于糧食作物更有利于提高復(fù)墾土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、有效鉀含量，加速生土熟化，改善生態(tài)環(huán)境。洪堅(jiān)平等[17]對煤矸石風(fēng)化物進(jìn)行復(fù)墾種植試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，種植綠肥牧草，有助于提高煤矸石風(fēng)化物中氮、磷、鉀等養(yǎng)分含量，增加復(fù)墾土壤微生物數(shù)量。王尚義等[18]研究發(fā)現(xiàn)，紫穗槐-高羊茅-紫花苜蓿模式有利于矸石山土壤堿解氮的積累；高羊茅-紫花苜蓿模式對土壤速效鉀和有機(jī)質(zhì)的改良效果最佳；紫花苜蓿蓋度與土壤中的堿解氮、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。但是目前，煤矸石填埋區(qū)復(fù)墾土壤真菌多樣性對不同植物的響應(yīng)機(jī)制如何目前尚不明確。

本研究主要以山西省古交市屯蘭礦區(qū)煤矸石填埋區(qū)為研究對象，利用高通量測序技術(shù)分析復(fù)墾土壤真菌多樣性對不同植物的響應(yīng)特征，以期為未來的礦區(qū)復(fù)墾與生態(tài)重建工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于山西省古交市屯蘭礦區(qū)。該區(qū)于2014年復(fù)墾為農(nóng)田，年平均氣溫約9.5 ℃；年平均降水量約460 mm，降水量大多集中在7，8月；無霜期約105 d，為溫帶大陸性氣候。2018年5月在試驗(yàn)區(qū)種植不同鄉(xiāng)土作物與綠肥植物，分別為玉米(Maize， M)、大豆(Soybean， S)、毛苕子(Hair-vetch， H)、苜蓿(Alfalfa，A)及自然恢復(fù)(Natural restoration，NR)。依據(jù)復(fù)墾區(qū)域面積，種植大豆、苜蓿各0.033 hm2，毛苕子0.066 hm2，玉米0.20 hm2，自然恢復(fù)區(qū)0.20 hm2，種植前所有種植區(qū)均進(jìn)行有機(jī)無機(jī)肥配施，有機(jī)肥中有機(jī)質(zhì)含量為53.48%，氮含量為2.2%，無機(jī)肥中養(yǎng)分含量為N∶P2O5∶K2O=18%∶12%∶10%，有機(jī)肥與無機(jī)肥均按照等氮量75 kg/hm2人工撒播施入；株距×行距為30 cm×55 cm；苜蓿、毛苕子均按照地壟撒播。

1.2 試驗(yàn)材料

供試玉米品種為金蘋618，大豆品種為晉豆21。

1.3 土樣采集

于2018年9月26日在作物收獲后，利用土鉆按照對角線法采集不同植物種植下0～20 cm的復(fù)墾土壤樣品。每個(gè)處理3次重復(fù)，將采集的土樣混合均勻，放入滅菌袋，密封后(4 ℃保溫箱)帶回室內(nèi)進(jìn)行養(yǎng)分與微生物試驗(yàn)；同時(shí)，未能及時(shí)進(jìn)行微生物培養(yǎng)試驗(yàn)的土樣放在-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、堿解氮、速效磷和有效鉀含量，參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測定。高通量測序是由上海派森諾生物公司對礦區(qū)復(fù)墾土壤進(jìn)行微生物組DNA提取，目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收純化、熒光定量等，利用MiSeq測序儀對不同植物種植下礦區(qū)復(fù)墾土壤真菌的可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit， OTU)進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0對土壤養(yǎng)分、Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行方差分析；利用Canoco 5.0軟件對土壤真菌屬與養(yǎng)分進(jìn)行RDA冗余分析；利用R軟件對土壤真菌群落進(jìn)行Lefse分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌OTU單元分析

從圖1可以看出，不同植物種植下復(fù)墾土壤中共有的OTU單元數(shù)量為67個(gè)；特有的OTU單元，大豆地最多，為227個(gè)；苜蓿地最少，為136個(gè)。 種植植物后土壤中OTU單元數(shù)量為514～732個(gè)，其中種植大豆后復(fù)墾土壤中OTU單元總量最多，為732個(gè)；而自然恢復(fù)下最少，僅為439個(gè)。

2.2 不同植物種植下土壤真菌門、屬特征分析

從圖2 可以看出，煤矸石填埋區(qū)復(fù)墾土壤中真菌門主要有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、絲足蟲類(Cercozoa)、纖毛門(Ciliophora)、球囊菌門 (Glomeromycota)、隱真菌門(Rozellomycota)和Anthophyta。其中，相對豐度大于5%的真菌門主要有子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。不同復(fù)墾區(qū)土壤中，子囊菌門在自然恢復(fù)下相對豐度最小，為36%，而在種植玉米、大豆、苜蓿和毛苕子后其相對豐度均在65%以上，且以種植毛苕子處理增幅最大；接合菌門在自然恢復(fù)下相對豐度最大，種植植物后降低了接合菌門的相對豐度，且以種植毛苕子后降幅最大，種植玉米降幅最?。环N植毛苕子后土壤中擔(dān)子菌門相對豐度最小。

圖1 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌OTU單元關(guān)系Fig.1 Relation of OTU in reclaimed soil fungi under different plants

圖2 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌門特征Fig.2 Characteristics of fungi phylum in reclaimed soil under different plant cultivation

從圖3 可以看出，煤矸石填埋區(qū)復(fù)墾土壤中相對豐度較高的前20種屬分別為被孢霉屬(Mortierella)、角單菌屬(Ceratobasiduim)、赤霉屬(Gibberella)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、短梗霉屬(Aureobasidium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、鐮孢菌屬(Fusarium)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、念珠菌屬(Candida)、枝頂孢霉屬(Acremonium)、根霉屬(Rhizopus)、毛殼屬(Chaetomium)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)、Olpidiaster屬、曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)、光黑殼屬(Preussia)、塊菌屬(Tuber)、囊根壺菌屬(Rhizophlyctis)、Knufia。其中，被孢霉屬的相對豐度均大于8%，且自然恢復(fù)下其相對豐度最大，為33.6%。人工種植植物降低了其豐度值，種植玉米相對豐度為20.9%，相對于自然恢復(fù)降幅最小，苜蓿相對豐度為8.38%，降幅最大。

圖3 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌屬特征Fig.3 Characteristics of fungi genera in reclaimed soil under different plant cultivation

2.3 不同植物種植下土壤真菌Alpha多樣性分析

從表1可以看出，不同植物種植下土壤真菌多樣性指標(biāo)Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)與Chao1指數(shù)均值均大于自然恢復(fù)。對于Simpson指數(shù)，種植大豆后最大，且自然恢復(fù)與不同植物種植間差異顯著(P<0.05)；Shannon指數(shù)在種植大豆和玉米后較大，二者差異不顯著，但均顯著高于自然恢復(fù)(P<0.05)；Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)均為種植毛苕子后最大，與種植玉米和大豆處理不顯著，但均顯著高于自然恢復(fù)(P<0.05)。說明相對于自然恢復(fù)，種植植物可以增加煤矸石填埋區(qū)復(fù)墾土壤中的真菌多樣性。

表1 不同植物種植下復(fù)墾土壤中真菌多樣性指數(shù)分析Tab.1 α-diversity index of fungi in reclaimed soil under different plant cultivation

2.4 不同植物種植下土壤真菌Beta多樣性分析

本研究采用NMDS分析(Nonmetric Multidimensional Scaling)不同植物種植下土壤真菌Beta多樣性。NMDS是通過降維處理簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，在新的低維坐標(biāo)系中對樣本重新排序，從而在特定距離尺度下描述樣本的分布特征。該分析不受樣本距離數(shù)值的影響，僅考慮彼此之間的大小關(guān)系，排序結(jié)果穩(wěn)定。

從圖4可以看出，NMDS1、NMDS2將自然恢復(fù)與植物種植相分離，自然恢復(fù)位于第1象限，玉米與大豆位于第2象限，毛苕子位于第3象限，苜蓿位于第4象限。說明4種不同植物種植中，種植大豆與玉米間差異不顯著，但與毛苕子、苜蓿間差異顯著；自然恢復(fù)與植物種植對煤矸石填埋區(qū)復(fù)墾土壤真菌組成及多樣性影響達(dá)顯著水平。

圖4 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌NMDS分析Fig.4 NMDS analysis of fungi in reclaimed soil under different plant cultivation

2.5 不同植物種植下土壤真菌多樣性Lefse差異分析

從圖5可以看出，不同植物種植下土壤中差異顯著的真菌26種，包括1個(gè)綱，7個(gè)目，11個(gè)科，7個(gè)屬；其中，差異顯著的綱為子囊菌綱(Sordariomycetes)，存在于種植大豆后復(fù)墾土壤中；差異顯著的屬在自然恢復(fù)土壤中包括被孢霉屬(Mortierella)、漆斑菌屬(Myrothecium)、埋核盤菌屬(Pyrenopeziza) 3種，種植大豆后土壤中包括腐質(zhì)霉屬(Humicola)和糞盤菌屬(Ascobolus)2種，種植玉米后土壤中有假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus) 1種，種植苜蓿后土壤中有支頂孢霉屬(Acremonium)1種。

圖5 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌分類單元差異Fig.5 Difference of fungal taxa in reclaimed soil under different plant cultivation

2.6 土壤真菌豐度與土壤養(yǎng)分含量RDA分析

從表2可以看出，不同植物種植下復(fù)墾土壤養(yǎng)分含量不同，除全鉀、全磷外，土壤中養(yǎng)分均為自然恢復(fù)最低；不同植物種植下土壤中全氮、有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量間存在顯著差異(P<0.05)，均為自然恢復(fù)最低，毛苕子下最高。

表2 不同植物種植下復(fù)墾土壤養(yǎng)分Tab.2 Nutrients of reclaimed soil under different plant cultivation

利用Canoco軟件對土壤中前50種真菌屬豐度與土壤養(yǎng)分含量進(jìn)行RDA分析。從圖6、表3可以看出，RDA1與RDA2分別可以解釋33.7%，9.54%，土壤真菌屬的相對豐度受到土壤中全氮、堿解氮和全磷的影響顯著，全氮、堿解氮和全磷的貢獻(xiàn)率分別為38.6%，17.9%，14.6%。

表3 真菌屬豐度與土壤養(yǎng)分含量的RDA分析結(jié)果Tab.3 RDA results of fungi abundance and soil nutrient content

圖6 不同植物種植下復(fù)墾土壤真菌RDA分析Fig.6 RDA of reclaimed soil under different plant cultivation

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1 種植植物影響復(fù)墾土壤真菌多樣性分析 土壤真菌數(shù)量巨大，種類繁多，是評價(jià)土壤質(zhì)量變化、土壤生態(tài)系統(tǒng)等功能方面有著重要作用[20]。微生物多樣性指數(shù)是評價(jià)土壤微生物群落多樣性的有效方法，多樣性指數(shù)高表明微生物群落多樣性就高[21]。劉淑霞等[22]研究表明，土壤擾動(dòng)和施肥能降低土壤真菌的多樣性。而本研究發(fā)現(xiàn)，自然恢復(fù)下土壤真菌多樣性指數(shù)最低，種植不同作物下的土壤真菌多樣性較高，說明種植植物可以促進(jìn)復(fù)墾土壤真菌的生長，有利于改善復(fù)墾土壤真菌多樣性。同時(shí)，結(jié)果也表明，種植毛苕子下的Chao1指數(shù)與ACE指數(shù)較高，大豆下的Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)較高，該結(jié)果與Liu等[23]的研究結(jié)果類似。 原因可能是由于不同作物的根系分泌物不同[24-27]，從而引起其土壤真菌微生物的物種多樣性與豐富度指數(shù)產(chǎn)生差異，導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)不同，真菌功能多樣性發(fā)生變化。

3.1.2 植物種類影響復(fù)墾土壤群落結(jié)構(gòu)分析 真菌群落結(jié)構(gòu)對土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡有重要作用。土壤特性和作物根系分泌物等對真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響較大。本研究表明，不同植物種植下復(fù)墾土壤中的真菌差異顯著的真菌綱、目、科、屬共有26種，可能是由于禾本科植物與豆科植物根系不同的分泌物會(huì)促生或抑制土壤中某些真菌微生物，進(jìn)而使不同植物下土壤中的微生物產(chǎn)生差異。子囊菌門大多為腐生菌，是土壤中重要的分解者[28]，可分解難降解的有機(jī)質(zhì)，在養(yǎng)分循環(huán)方面起著重要作用[29]。本研究結(jié)果表明，復(fù)墾土壤中子囊菌門相對豐度最大，為優(yōu)勢真菌門，在植物種植下占比均達(dá)65%以上，遠(yuǎn)高于自然恢復(fù)下的36%，說明種植植物相較于自然恢復(fù)有利于有益真菌門(子囊菌門)的增加。本研究中，被孢霉屬的含量均大于8%，為該復(fù)墾土壤中的優(yōu)勢屬。被孢霉屬是一種具有較強(qiáng)分解纖維素能力的真菌，且接合菌門類下的被孢霉屬為對土壤有益的微生物[30]。本研究中，被孢霉屬均來自接合菌門，且被孢霉屬在自然恢復(fù)土壤中占比最大，為33.6%，種植植物后土壤中被孢霉屬豐度降低，種植玉米后土壤中被孢霉屬占20.9%，降幅最小，說明種植植物會(huì)抑制該復(fù)墾土壤中被孢霉屬的生長。

3.1.3 復(fù)墾土壤養(yǎng)分與真菌群落多樣性的關(guān)系 土壤養(yǎng)分與真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性有著密切聯(lián)系。Hazard等[31]研究表明，土壤有機(jī)質(zhì)等對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)產(chǎn)生重要影響。Bastian 等[32]研究認(rèn)為，土壤有機(jī)質(zhì)是影響農(nóng)田土壤真菌群落主要的驅(qū)動(dòng)者。高玉峰等[33]研究表明，土壤堿解氮含量的高低會(huì)影響土壤真菌的種類和數(shù)量。milauer等[34]研究認(rèn)為，土壤磷與真菌群落結(jié)構(gòu)或多樣性相關(guān)性不大。由此可見，不同學(xué)者在不同研究區(qū)研究得出的結(jié)論有所差異。而本研究通過RDA分析，結(jié)果表明，全氮、全磷、堿解氮對復(fù)墾土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著。這可能與試驗(yàn)區(qū)所在地理位置、土壤、氣候等因素有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步深入研究。

3.2 結(jié)論

綜上，煤矸石填埋區(qū)復(fù)墾土壤真菌多樣性在植物種植與自然恢復(fù)間差異較大，植物種植下土壤多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)均高于自然恢復(fù)，植物種植相較于自然恢復(fù)提高了土壤中子囊菌門的相對豐度，但降低了被孢霉屬的相對豐度，且不同植物種植下土壤中有不同的優(yōu)勢真菌屬，土壤中全氮、全磷和堿解氮含量是導(dǎo)致煤矸石填埋區(qū)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的主要驅(qū)動(dòng)因素。