官亞琳，湯 珣，張冬瑞，夏德鑫，李 杰，劉守銀，宋春華，常 纓

(東北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)屬于鱗毛蕨科鱗毛蕨屬落葉多年生藥用草本植物，一般生長于樹林下或巖石縫里，主要分布在黑龍江省五大連池市，受大陸季風性氣候影響，該地區(qū)降水量多而集中，極端最低氣溫-41.0 ℃，極端最高氣溫36.5 ℃[1]，是研究植物抗逆(低溫、高溫和鹽等)的珍貴材料。因此，開展香鱗毛蕨抗逆機制研究對于豐富植物抗逆的理論、推動黑龍江高寒地區(qū)藥用植物資源栽培具有重要的理論和現(xiàn)實意義。TCP蛋白是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子的一個小家族，通過調(diào)節(jié)細胞生長和增殖，在植物生長發(fā)育的多個過程以及對外界環(huán)境的響應中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[2-5]。TCP蛋白具有TCP結(jié)構(gòu)域的特點，該結(jié)構(gòu)域是一個高度保守的N-端59個堿基螺旋環(huán)(bHLH)結(jié)構(gòu)，與DNA結(jié)合、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)核定位有關(guān)[6]。根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域的序列特征和同源性，將TCP家族成員分為2個亞家族：Ⅰ類(以PCF蛋白為代表)和Ⅱ類(以CYC和TB1為代表)[4，7]，這2個亞家族之間最顯著的區(qū)別是，Ⅰ類成員在TCP結(jié)構(gòu)域的基本區(qū)域顯示出4個氨基酸的缺失[4]，而Ⅱ類TCP成員根據(jù)其TCP域的不同進一步細分為2個子類(CIN和CYC/TB1)，此外，一些Ⅱ類成員有一個具有未知功能的精氨酸基序(R結(jié)構(gòu)域)，這被假設與促進蛋白質(zhì)相互作用有關(guān)[3-4]。研究表明，TCP轉(zhuǎn)錄因子幾乎參與調(diào)控所有植物生長發(fā)育的多個生理和生物學過程包括對逆境的響應，還參與植物激素信號轉(zhuǎn)導過程，如赤霉素(GA)、脫落酸(ABA)、獨腳金內(nèi)酯(SL)、茉莉酸(JA)、生長素(IAA)和細胞分裂素(CTK)[8-12]。對于Ⅰ類TCP基因，通過減少水損失和活性氧，并上調(diào)與ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯、IAA和CTK信號途徑相關(guān)的基因，水稻(Oryzasativa)OsTCP19的過表達提高了植物對NaCl和甘露醇脅迫的耐受性[13-14]。對于Ⅱ類TCP基因，水稻OsTCP14和OsTCP21的過表達增加了植物對冷脅迫的敏感性[15]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中TCP14與轉(zhuǎn)錄因子DOF6結(jié)合互作后阻止DOF6激活ABA生物合成基因ABADEFICIENT1(ABA1)和其他ABA相關(guān)的脅迫基因，拮抗了ABA信號傳導而促進種子萌發(fā)[16-17]。迄今為止，在雙子葉植物和單子葉植物中都發(fā)現(xiàn)了一些完整的TCP家族成員，它們通過參與植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑來調(diào)控植物對非生物脅迫的響應，表明TCP家族可能在植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑和非生物脅迫的響應這個龐大復雜的調(diào)控網(wǎng)絡中扮演著至關(guān)重要的角色，如擬南芥[18]、西紅柿(Solanumlycopersicum)[19]、蘋果(Malusdomestica)[20]、草莓(Fragariaananassa)[21]和竹子(Phyllostachysedulis)[22]。近期研究結(jié)果表明，TCP轉(zhuǎn)錄因子表達受ABA、水楊酸(SA)、MeJA等激素及溫度、高鹽和干旱等非生物脅迫誘導，但在香鱗毛蕨中，有關(guān)DfTCP與抗逆的研究鮮有報道。本研究對香鱗毛蕨DfTCP基因進行生物信息學預測分析，同時通過實時熒光定量PCR測定其在逆境環(huán)境下的相對表達水平，進而探索TCP轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控香鱗毛蕨抗逆性的機制，為豐富香鱗毛蕨抗逆理論和實現(xiàn)種植業(yè)的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

香鱗毛蕨長至幼苗期時，分別對其進行鹽(200 mmol/L NaCl)、干旱(20% PEG)、高溫(42 ℃)和低溫(4 ℃)處理。分別在0，0.5，1，3，6，12，24，48 h取材，剪成1 cm小段，分別裝袋，用液氮迅速冷凍后置-80 ℃冰箱備用。

當植株長至幼苗期時，分別對其葉片噴施100 μmol/L SA、100 μmol/L MeJA、10 μmol/L ABA和500 μmol/L Eth，噴施蒸餾水為對照。分別在0，0.5，1，3，6，12，24，48 h取材，剪成1 cm小段，分別裝袋，用液氮迅速冷凍后置-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和實時熒光定量PCR分析 采用TRIzol方法提取葉片總RNA(購自全式金生物科技有限公司，北京)參照說明書進行，cDNA合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自全式金生物科技有限公司，北京)說明書進行。使用Primer Premier 5.0軟件設計DfTCP的qRT-PCR特異引物，正向引物和反向引物序列分別為5′-GCTAACTACGGAGGCACAG-3′和5′-TCCCATCCACCTTCGTAT-3′。以Df18sRNA為內(nèi)參基因，其擴增引物序列為5′-GCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTTC-3′和5′-TGGTCCTATTATGTTGGTCTTCGG-3′。SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)為PCR反應試劑，實時熒光定量PCR反應系統(tǒng)為Mx-3000p Real-time PCR System。每個反應體系共20 μL，包含10 μL的SYBR Premix ExTaqⅡ(10×)，0.4 μL的PCR Forward Primer(10 μmol/L)，0.4 μL的PCR Reverse Primer(10 μmol/L)，1 μL的DNA模板和8.2 μL的滅菌水。反應程序：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸30 s。每個樣品重復3次，采取2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量。3次生物學重復，數(shù)據(jù)顯著性分析采用GraphPad Prism 8軟件。

1.2.2 生物信息學分析 通過NCBI中的BlastP在線工具進行其他物種的同源氨基酸序列檢索，使用ClustalX 1.8和DNAMAN進行氨基酸序列同源比對，上述獲得物種序列經(jīng)過Mega 6.0軟件中的鄰接法算法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，設置參數(shù)為Bootstrap進行1 000次檢驗并去除支持率低于50%的節(jié)點，選取P-distance模型，Pairwise deletion處理數(shù)據(jù)缺失。TCP蛋白的理化性質(zhì)由ExPASy-ProtParam tool在線軟件分析(http：//web.expasy.org/protparam/)，利用SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsasopma.html)和SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)在線軟件預測TCP蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)亞細胞定位預測(http：//www.softberry.com/)，蛋白質(zhì)信號肽預測(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)，蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DfTCP蛋白的理化性質(zhì)

DfTCP基因含有一個1 431 bp開放閱讀框并且編碼477個氨基酸。經(jīng)ExPASy-ProtParam tool在線預測分析，DfTCP蛋白的相對分子質(zhì)量為51.74 ku，理論等電點(pI)為6.29，是弱酸性蛋白。DfTCP蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為54.03，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)(<40，蛋白質(zhì)穩(wěn)定)；脂肪族系數(shù)(Aliphatic index)為64.26，總平均親水系數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.698，表明該蛋白是親水蛋白，由20種氨基酸組成，分子式為C2246H3508N676O705S15；保守結(jié)構(gòu)域預測顯示，該蛋白屬于TCP家族；SignalP和TMHMM Server v. 2.0表明，該蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非分泌蛋白；利用Softberry在線程序?qū)fTCP蛋白亞細胞定位預測結(jié)果顯示，DfTCP定位于細胞外。

2.2 DfTCP蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預測

利用NPS@ server在線對TCP蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)中有α-螺旋(H)69個、延伸片段(E)71個和無規(guī)則卷曲(C)337個，分別占總蛋白的14.47%，14.88%，70.65%。當H>45%、E<5%時該蛋白結(jié)構(gòu)為all-alpha型；當H<5%、E>45%時為all-beta型；當H>30%、E>20%時為alpha-beta型；其他情況為mixed型。預測結(jié)果表明，TCP蛋白二級結(jié)構(gòu)為mixed型。

為了進一步了解預測TCP的蛋白特性，使用同源建模在線預測SWISS-MODEL分析系統(tǒng)進行三維模型的構(gòu)建，結(jié)果構(gòu)建模板蛋白為5zkt.1.A，TCP與模板的氨基酸序列同源性為80%，GMQE (Global Model Quality Estimation)值為0.04，QSQE值為0.15。

2.3 DfTCP蛋白質(zhì)多序列比對

經(jīng)過DNAMAN(Version 7.0)軟件進行多序列比對顯示，DfTCP蛋白質(zhì)與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtTCP20、克萊門柚(Citrusclementina)CcTCP20、西紅柿(Solanumlycopersicum)SlTCP14和無油樟(Amborellatrichopoda)AtrTCP20蛋白質(zhì)相似性分別為59.48%，80.26%，54.36%，80.52%，在DfTCP蛋白質(zhì)序列中79-138為典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，含有Basic、Helix 1、Loop、Helix Ⅱ和R-domain，本研究DfTCP屬于Ⅱ類(以CYC和TB1為代表)(圖1)。

2.4 DfTCP蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹和Motif結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，利用Mega 6.0軟件對DfTCP與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtTCP20、克萊門柚(Citrusclementina)CcTCP20、無油樟(Amborellatrichopoda)AtrTCP20、野生油橄欖樹(Oleaeuropaeavar.Sylvestris)OeTCP20、木豆(Cajanuscajan)CcaTCP20、葡萄(Vitisvinifera)VvTCP11、菠蘿(Ananascomosus)AcTCP20、虎爪豆(Mucunapruriens)MpTCP20、鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)DcTCP20、豇豆(Vignaunguiculate)VuTCP20、綠豆(Vignaradiatavar.radiata)VrTCP20、蔓花生(Arachisduranensis)AdTCP20和AdTCP21、花生(Arachishypogaea)AhTCP20、芝麻(Sesamumindicum)SiTCP7、蓖麻(Ricinuscommunis)RcTCP11、高粱(Sorghumbicolor)SbTCP20、谷子(Setariaitalica)SitTCP20、大豆(Glycinemax)GmTCP、擬南芥AtTCP4、玉米(Zeamays)ZmTCP和茶樹(Camelliasinensis)CsTCP蛋白質(zhì)序列進行分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining)的算法構(gòu)建進化樹，結(jié)果表明，DfTCP與AdTCP21、VvTCP11和RcTCP11聚到一組，而與其他植物的TCP聚類關(guān)系較遠。

經(jīng)在線分析軟件MEME(http：//meme.nbcr.net/meme/)對DfTCP蛋白質(zhì)進行保守Motif預測，Motif序列如表1所示。TCP蛋白含有15個Motif，Motif的長度在10～50 aa。除大豆、茶樹和擬南芥，其余植物的TCP蛋白均具有Motif1；除大豆、茶樹、蔓花生AdTCP21和擬南芥，其余植物的TCP蛋白均具有Motif3。其中Motif1含有bHLH結(jié)構(gòu)域。

下劃線為bHLH結(jié)構(gòu)域。 The underline is the bHLH domain.

圖2 DfTCP蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育進化樹和保守MotifFig.2 Phylogenetic tree and conserved Motif of DfTCP protein

表1 Motif序列Tab.1 Motif sequence

2.5 DfTCP基因在香鱗毛蕨中的組織表達特異性

如圖3所示，香鱗毛蕨葉柄和葉片中DfTCP的相對表達量極顯著高于根中(P<0.01)，且葉柄>葉>根。

2.6 外源激素(SA、ABA、MeJA和Eth)對香鱗毛蕨葉片DfTCP基因表達模式的影響

qRT-PCR分析外源激素SA、ABA、MeJA和Eth誘導香鱗毛蕨葉片中DfTCP的表達模式，結(jié)果圖4所示，在外源激素SA處理下，香鱗毛蕨葉片中DfTCP的相對表達量表現(xiàn)為明顯的“升-降-升-降”趨勢，在0.5，12 h達到峰值，并且極顯著高于對照(P<0.01)，但在3，24，48 h極顯著低于對照(P<0.01)，在1，6 h與對照組差異不顯著(P>0.05)；外源激素ABA處理下，DfTCP的相對表達量整體上調(diào)且呈現(xiàn)先升后降的趨勢，與對照組相比，在1，3，6，12，24，48 h時，香鱗毛蕨葉片中DfTCP的相對表達量差異均達到極顯著(P<0.01)，而在0.5 h，香鱗毛蕨葉片中DfTCP的相對表達量差異不顯著(P>0.05)；外源激素MeJA和Eth處理下，香鱗毛蕨葉片中DfTCP的相對表達量均隨處理時間的增長表現(xiàn)為“降-升-降”的趨勢，分別在6，1 h達到峰值，除峰值極顯著高于對照(P<0.01)外，MeJA處理下，0.5，1，3，12，24，48 h香鱗毛蕨葉片中DfTCP的相對表達量均極顯著低于對照(P<0.01)，Eth處理下，48 h香鱗毛蕨葉片中DfTCP的相對表達量顯著低于對照(P<0.05)，其他各時間點均極顯著低于對照(P<0.05)。

不同大寫字母表示差異達極顯著水平(P<0.01)；不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。圖4-5同。

圖4 不同時間下外源激素(SA、ABA、MeJA和Eth)對香鱗毛蕨葉片DfTCP相對表達量的影響Fig.4 Effects of exogenous hormones(SA，ABA，MeJA and Eth) on the relative expression level of DfTCP in the leaves of Dryopteris fragrans under different times

2.7 非生物脅迫(干旱、鹽、高溫和低溫)對香鱗毛蕨葉片DfTCP基因表達模式的影響

如圖5所示，在PEG和NaCl處理條件下，香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量均隨處理時間的延長呈現(xiàn)“降-升-降”的變化規(guī)律。PEG處理時，僅3，6 hDfTCP的相對表達量極顯著高于對照(P<0.01)，其余時間DfTCP的相對表達量與對照差異均不顯著(P>0.05)；NaCl處理時，在12 hDfTCP的相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)，且達到峰值，其他各時間點均與對照差異不顯著(P>0.05)。

不同溫度處理下，香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量均隨著時間延長呈先增后降趨勢。在高溫42 °C處理過程中，0.5，1 h香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量極顯著高于對照組(P<0.01)，在0.5 h達到峰值，6，12，24，48 h香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，3 h香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；低溫4 ℃處理時，1，3 h香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量極顯著高于對照(P<0.01)，且3 h達到峰值，0.5 h時顯著高于對照(P<0.05)，6，12，24，48 h香鱗毛蕨葉片DfTCP的相對表達量與對照差異均不顯著(P>0.05)。

圖5 不同時間下非生物脅迫(PEG、NaCl、高溫和低溫)對香鱗毛蕨葉片DfTCP相對表達量的影響Fig.5 Effects of abiotic stress (PEG，NaCl，high temperature and low temperature) on the relative expression level of DfTCP in the leaves of Dryopteris fragrans under different times

3 結(jié)論與討論

由多基因編碼的植物特異性TCP轉(zhuǎn)錄因子已在茶樹、大豆等植物中得到了全面鑒定[7，23-24]。然而，TCP基因在香鱗毛蕨中的生物學作用尚不清楚。TCP轉(zhuǎn)錄因子是一個具有保守的TCP結(jié)構(gòu)域的植物特異性蛋白質(zhì)家族。本研究發(fā)現(xiàn)DfTCP N端含有一個59個堿基螺旋環(huán)(bHLH)基序，是一個典型的TCP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在DNA結(jié)合和蛋白質(zhì)相互作用中起著重要的作用，而C端序列具有高度的變異性。TCP轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達模式在擬南芥[4]、玉米[25]、茶樹[26]和白菜(Brassicapekinensis)[27]等植物中已有報道，但其在香鱗毛蕨中的組織表達特性研究較少。本研究通過對DfTCP基因的表達模式分析，結(jié)果表明，DfTCP基因的表達具有組織特異性，在香鱗毛蕨根中表達量較低，而在葉柄和葉片組織部位的相對表達量較高，這與茶樹TCP組織表達特異性一致[26]。

作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，TCP廣泛參與植物生長發(fā)育進程，并在多種信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮重要作用，例如乙烯、JA、SA和ABA等植物激素的合成和信號轉(zhuǎn)導[28-30]。本研究結(jié)果表明，通過4種不同激素處理，發(fā)現(xiàn)DfTCP能夠響應ABA信號，隨著時間的延長，DfTCP的相對表達量逐漸升高，僅48 h的表達量有所下降，總體呈現(xiàn)上調(diào)表達。表明DfTCP轉(zhuǎn)錄因子在香鱗毛蕨生長發(fā)育及激素信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮作用，推測其可能通過激素信號轉(zhuǎn)導途徑參與調(diào)節(jié)植物生長。在水稻和茶樹中，TCP也參與影響植株對ABA信號的響應[26，31]。研究報道TCP轉(zhuǎn)錄因子對JA、SA和其他脂肪酸的生物合成具有重要意義，在脂肪酸合成基因的啟動子區(qū)域大量存在TCP結(jié)合位點[32]。TCP轉(zhuǎn)錄因子還可以調(diào)節(jié)SA的合成，SA是一種在調(diào)節(jié)免疫防御中的拮抗激素[33]。本試驗表明，外源激素MeJA處理下，在6 hDfTCP的相對表達量上調(diào)，其余時間均下調(diào)表達；SA和Eth處理時，DfTCP的相對表達量均呈現(xiàn)不同的趨勢，說明DfTCP可能參與調(diào)控香鱗毛蕨SA和Eth的信號轉(zhuǎn)導途徑。在茶樹中也發(fā)現(xiàn)了類似情況[34]。

越來越多的研究表明，非生物脅迫(鹽、干旱、高溫和低溫)阻礙了植物的最佳生理生化機制[35]。在動態(tài)生長條件下，植物抗逆性的一個關(guān)鍵因素是它們對生物和非生物環(huán)境信號的概念化、整合和調(diào)節(jié)能力，從而可能調(diào)節(jié)分子和生理代謝以維持其生存。這種非生物脅迫還激活TCP，并觸發(fā)一個信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡，以增強植物的脅迫耐受性[31]。研究表明，TCP家族在許多植物生長發(fā)育過程中都起著關(guān)鍵作用，例如水稻的發(fā)育和對非生物脅迫的表達模式[36]。本試驗研究表明，鹽、干旱、高溫和低溫處理后，香鱗毛蕨葉片中DfTCP基因表達普遍上調(diào)，表明DfTCP轉(zhuǎn)錄因子作為抗逆相關(guān)蛋白，在逆境脅迫下促進其表達。研究表明，水稻OsTCP19參與調(diào)節(jié)ROS機制，有助于產(chǎn)生應激反應，包括增強抗氧化酶(如SOD、POD、CAT和APX)的活性；也可以通過提高酶促或非酶促抗氧化劑的水平來保護其免受氧化損傷[36-37]。香鱗毛蕨TCP也可能參與調(diào)節(jié)ROS機制。

綜上所述，TCP轉(zhuǎn)錄因子在香鱗毛蕨抗逆性的機制以及植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑的響應這個龐大復雜的調(diào)控網(wǎng)絡中扮演著至關(guān)重要的角色。但TCP轉(zhuǎn)錄因子在香鱗毛蕨生長發(fā)育及多種信號通路中發(fā)揮的具體作用機制，還需進一步深入研究。