宋文騰，馬自飛，史美華，白菁華，路文靜，肖 凱

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001 )

促分裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK) 級(jí)聯(lián)途徑 (MAPKKK-MAPKK-MAPK) 是真核生物中保守的信號(hào)傳導(dǎo)模塊[1]，在該級(jí)聯(lián)通路中，通過MAPKKK-MAPKK-MAPK逐級(jí)磷酸化的傳遞方式傳遞胞內(nèi)信號(hào)[2]。植株體內(nèi)MAPK級(jí)聯(lián)途徑通過將特定信號(hào)放大及調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞骨架的活性等[3]，對(duì)植株生長、發(fā)育和抵御環(huán)境逆境的能力產(chǎn)生重要影響[4-5]。模式植物擬南芥中MAPKK，依據(jù)編碼蛋白的氨基酸序列保守性特征，將該基因家族成員進(jìn)一步劃分為A、B、C、D 4個(gè)亞組[5]。其中，A亞組包括AtMKK1、AtMKK2和AtMKK63個(gè)基因，B亞組包括AtMKK31個(gè)基因，C亞組包括AtMKK4、AtMKK52個(gè)基因，D亞組包括AtMKK7、AtMKK8、AtMKK9和AtMKK104個(gè)基因。MAPK級(jí)聯(lián)途徑中MAPKK蛋白在感受上游信號(hào)、激活下游蛋白及傳遞信號(hào)中發(fā)揮重要作用[6]。

MAPK特定級(jí)聯(lián)組分基因在介導(dǎo)植株生長發(fā)育、免疫響應(yīng)以及適應(yīng)各種生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[6-7]。相關(guān)研究多以模式植物擬南芥MAPKKK和MAPK家族成員為對(duì)象，有關(guān)MAPKK家族成員的功能鑒定研究報(bào)道尚少[8]。Xu等[8]對(duì)植物種屬特定MAPKK家族基因介導(dǎo)植株生長和發(fā)育的信號(hào)傳遞機(jī)制進(jìn)行了研究。Wersch等[9]對(duì)擬南芥MAPKK6介導(dǎo)花青素合成的生物學(xué)功能進(jìn)行了探討。進(jìn)一步揭示植物種屬M(fèi)APKK家族基因特征及信號(hào)感受和傳遞機(jī)制，對(duì)于深入闡明植物抵御非生物逆境的分子機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義。

磷素是作物生長必需的礦質(zhì)元素，提高作物磷素利用效率對(duì)于促進(jìn)我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要實(shí)踐意義[10]。作者在前期開展小麥MAPK級(jí)聯(lián)途徑基因的分子特征和表達(dá)模式研究中發(fā)現(xiàn)，該種屬中MAPKK家族成員TaMAPKK3呈低磷逆境下上調(diào)表達(dá)特征，表明該基因通過轉(zhuǎn)錄應(yīng)答，在介導(dǎo)植株響應(yīng)低磷逆境中發(fā)揮重要作用?；诖?，本研究針對(duì)迄今有關(guān)麥類種屬M(fèi)APK級(jí)聯(lián)途徑分子機(jī)制研究有待深入的現(xiàn)狀，對(duì)該基因的分子特征及介導(dǎo)植株抵御低磷逆境的功能進(jìn)行了研究，旨在為今后小麥磷高效遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥抗逆生理和分子實(shí)驗(yàn)室前期鑒定的磷高效普通小麥品種石新828為基因克隆和表達(dá)材料，煙草品種Wisconsin 35為轉(zhuǎn)基因受體材料；遺傳轉(zhuǎn)化選用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105；雙元表達(dá)載體為pCAMBIA3301。以上材料均由小麥抗逆生理和分子課題組所屬實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)主要試劑包括RT-PCR試劑、qRT-PCR試劑、限制性內(nèi)切酶、pUCm-T載體、T4連接酶等，均購自上海生工。

1.2 TaMAPKK3基因克隆及分子特征分析

利用DNAStar工具鑒定供試小麥種屬M(fèi)APKK家族基因TaMAPKK3(登錄號(hào)：KT187393)編碼蛋白、蛋白分子量和等電點(diǎn)。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Blast工具查找供試基因編碼蛋白的植物種屬同源蛋白，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 TaMAPKK3應(yīng)答低磷逆境的表達(dá)模式研究

以前期鑒定的磷高效小麥品種石新828為材料，采用Sun等[11]的方法建立MS溶液培養(yǎng)體系，設(shè)置低磷逆境處理小麥幼苗。采用Guo等[12]的方法，鑒定供試基因TaMAPKK3應(yīng)答低磷逆境下不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式。擴(kuò)增目標(biāo)基因正向引物為：5′-GCTGTTCATTATTACCT-3′；反向引物為：5′-CACCTTTCAACTTCTTT-3′。以小麥組成型表達(dá)基因Tatubulin(登錄號(hào)：U76558)為內(nèi)參基因(正向引物5′-CATGCTTATCCCTCGTCTCGACCT-3′和反向引物5′-CGCACTTCATGATGGAGTTGTAT-3′)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，循環(huán)25次；72 ℃15 s。依據(jù)2-ΔΔCT公式計(jì)算供試基因各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)豐度。

1.4 低磷處理下TaMAPKK3轉(zhuǎn)化株系植株生長鑒定

采用RT-PCR擴(kuò)增TaMAPKK3編碼閱讀框(ORF)。采用的正向引物為5′-AAACCATGGCGGGGCT GGAGGAG-3′(NcoⅠ)；反向引物為5′-AAAGGTCACCTCATGCTTGGATAATGTA-3′(BstpⅠ)。將擴(kuò)增產(chǎn)物融合至表達(dá)載體pCAMBIA3301啟動(dòng)子下游，采用Guo等[12]農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草 (cv. Wisconsin 35)。

以獲得的T32個(gè)典型供試基因轉(zhuǎn)化株系 (Sen-2和Sen-3) 和野生型 (Wild type，WT) 對(duì)照為材料，采用前述的小麥低磷處理方法對(duì)轉(zhuǎn)化株系和WT進(jìn)行低磷處理。處理42 d，用相機(jī)拍照記錄植株表型，采用常規(guī)方法測(cè)定植株地上組織及根系鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。

1.5 低磷處理下TaMAPKK3轉(zhuǎn)化株系含磷量和光合參數(shù)測(cè)定

以低磷處理下上述轉(zhuǎn)化株系和WT為材料，采用Sun等[11]的磷鉬黃比色法測(cè)定植株地上組織和根系含磷量。通過含磷量與植株干質(zhì)量乘積獲得植株地上組織、根系及植株磷累積量。采用Guo等[12]的方法，利用便攜式Li-6400光合系統(tǒng)儀，測(cè)定供試材料不同葉位 (第4葉和第6葉) 光合速率 (Pn)、氣孔導(dǎo)度 (Gs)、光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)效率 (ΦPSⅡ) 和葉綠素非光化學(xué)淬滅系數(shù) (NPQ)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Microsoft Excel 2013和SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、處理和統(tǒng)計(jì)分析。各測(cè)定數(shù)據(jù)均源于3次測(cè)試重復(fù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaMAPKK3分子特征

TaMAPKK3cDNA全長為1 572 bp，編碼523個(gè)氨基酸，蛋白分子量58.508 ku，等電點(diǎn)(PI) 5.72。編碼蛋白含MAPKKs結(jié)構(gòu)域(78-347 aa)和核轉(zhuǎn)移因子結(jié)構(gòu)域(370-520 aa) 2個(gè)結(jié)構(gòu)域， MAPKK結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有激活位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)和多肽結(jié)合位點(diǎn) (圖1-A)，屬于MAPKKs中B亞組。在氨基酸水平上，TaMAPKK3與烏拉爾圖小麥(T.urartu)TuMAPKK6呈序列相似特征 (圖1-B)，表明它們具有相似的進(jìn)化途徑。

圖1 TaMAPKK3蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化特征Fig.1 The domain and phylogenetic properties of the TaMAPKK3 protein

2.2 TaMAPKK3低磷逆境下的表達(dá)模式

正常生長條件下，TaMAPKK3的表達(dá)水平較低。低磷處理后，該基因表達(dá)豐度表現(xiàn)為27 h內(nèi)隨著處理進(jìn)程不斷上升；進(jìn)行恢復(fù)處理后，植株根葉中該基因的表達(dá)水平隨恢復(fù)進(jìn)程不斷降低 (圖2)。表明TaMAPKK3呈典型的低磷應(yīng)答表達(dá)模式。

2.3 低磷處理下超表達(dá)TaMAPKK3株系的生長特征

采用qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)化株系靶基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)，以顯著增多轉(zhuǎn)錄本株系Sen-2和Sen-3 (圖3-A) 為材料，對(duì)其低磷逆境下植株生長特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與野生型相比，Sen-2和Sen-3株系植株個(gè)體增大、長勢(shì)更好，根系發(fā)育明顯改善 (圖3-B)，植株地上組織和根系鮮質(zhì)量顯著增加，干物質(zhì)積累量顯著提高 (圖3-C、D)。上述結(jié)果表明，超表達(dá)TaMAPKK3基因具有增強(qiáng)低磷逆境下植株生長和改善根系發(fā)育的能力。

R.恢復(fù)處理。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3-4同。 R. Indicates recovery treatment. Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05). The same as Fig.3-4.

2.4 低磷處理下超表達(dá)TaMAPKK3株系磷素吸收和光合特性

低磷處理下，與野生型相比，Sen-2和Sen-3植株地上組織和根系磷濃度顯著增高 (圖4-A)，上述器官磷累積量和植株磷總累積量顯著增多 (圖4-B)。表明TaMAPKK3介導(dǎo)植株抵御低磷逆境能力的增強(qiáng)，與其增強(qiáng)植株根系建成及改善植株磷素吸收能力有關(guān)。與野生型相比，轉(zhuǎn)化株系各測(cè)試葉位 (第4、6葉) 光合速率 (Pn) (圖4-C)、氣孔導(dǎo)度 (Gs) (圖4-D) 和光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)效率 (ΦPS Ⅱ) (圖4-E) 顯著提高，葉綠素非光化學(xué)猝滅系數(shù) (NPQ)顯著降低 (圖4-F)。表明TaMAPKK3通過改善根系發(fā)育和磷素吸收，促進(jìn)光合器官碳同化功能，進(jìn)而增強(qiáng)逆境脅迫下植株干物質(zhì)生產(chǎn)能力。

圖3 低磷處理下TaMAPKK3轉(zhuǎn)化株系生長特征Fig.3 The plant growth characteristic of the TaMAPKK3 overexpressing lines under low-P treatment

3 討論與結(jié)論

MAPK級(jí)聯(lián)途徑通過逐級(jí)磷酸化進(jìn)行胞內(nèi)信號(hào)傳遞的方式，與其通路組分特定蛋白保守位點(diǎn)有關(guān)，例如ATP結(jié)合位點(diǎn)、激酶活化位點(diǎn)和肽鏈互作位點(diǎn)等[13-14]。本研究表明，TaMAPKK3編碼蛋白含有典型MAPKKs家族蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在激酶活化位點(diǎn)、ATP結(jié)合位點(diǎn)等功能位點(diǎn)；在370-520 aa組成NTF2結(jié)構(gòu)域，表明TaMAPKK3屬于B亞組MAPKKs，有關(guān)上述結(jié)構(gòu)域的功能有待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，TaMAPKK3在進(jìn)化關(guān)系上與烏拉爾圖小麥TuMAPKK6蛋白高度同源，說明它們可能源自同一祖先，在介導(dǎo)信號(hào)傳遞中發(fā)揮相似的生物學(xué)功能。

特定MAPK級(jí)聯(lián)通路組分家族基因，會(huì)通過提高轉(zhuǎn)錄豐度參與對(duì)特定逆境的響應(yīng)[15-16]。例如，當(dāng)擬南芥遭遇鹽脅迫時(shí)其MPK4和MPK6表達(dá)量明顯上升[17-18]。在本研究中，在低磷處理下，TaMAPKK3轉(zhuǎn)錄豐度隨處理時(shí)間的加長提升，復(fù)磷處理后，供試基因轉(zhuǎn)錄本恢復(fù)到初始水平。表明該基因通過在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)低磷逆境信號(hào)產(chǎn)生應(yīng)答，進(jìn)而參與對(duì)低磷逆境信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。有關(guān)該小麥MAPKK家族基因應(yīng)答低磷逆境的啟動(dòng)子順式作用元件及轉(zhuǎn)錄機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

圖4 低磷處理下轉(zhuǎn)化株系的磷素吸收和光合特性Fig.4 The Pi uptake and the photosynthetic characteristic of the transgenic lines under low-P treatment

異源表達(dá)擬南芥AtMPKK2煙草株系，低溫和鹽分耐受性顯著增強(qiáng)[19-20]。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得超表達(dá)TaMAPKK3的轉(zhuǎn)基因煙草植株；低磷處理下，與野生型相比，超表達(dá)TaMAPKK3煙草植株生長狀況顯著改善，植株磷含量增加，光合碳同化能力增強(qiáng)。說明TaMAPKK3能夠提高煙草植株抵御低磷脅迫的能力。有關(guān)TaMAPKK3增強(qiáng)植株耐低磷脅迫的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

TaMAPKK3編碼蛋白含有MAPKKs結(jié)構(gòu)域和NTF2蛋白結(jié)構(gòu)域，歸屬于MAPKKs B亞組，在氨基酸水平上與烏拉爾圖小麥TuMAPKK6呈高度序列一致性特征。該基因呈典型低磷誘導(dǎo)表達(dá)模式。低磷處理下，超表達(dá)TaMAPKK3煙草植株較野生型長勢(shì)增強(qiáng)，干質(zhì)量增多，磷素積累量增加，光合能力提高。綜合說明TaMAPKK3在介導(dǎo)植株抵御低磷脅迫中發(fā)揮重要作用。