翟曉艷，裴 亮，周儒奎，楊 蓉，楊李旺，趙煥新，季新燕，張育敏，儲(chǔ)開博

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)解剖教研室，山西晉中030619； 2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，山西太原030001；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室，山西晉中030619）

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化能力的未分化細(xì)胞，在組織修復(fù)方面起重要作用。干細(xì)胞移植治療已經(jīng)被公認(rèn)為多種疾病的有效治療方法，例如韌帶損傷、骨損傷、軟骨損傷和心肌梗死等，然而在老年患者的應(yīng)用效果欠佳［1］。究其原因，年齡是重要原因之一，年齡可以引起干細(xì)胞數(shù)量減少以及增殖能力下降、凋亡水平增高——呈現(xiàn)出衰老的表型，影響干細(xì)胞的治療效果［2］。因此，使老年干細(xì)胞年輕化、提高干細(xì)胞的活性是有效解決老年患者干細(xì)胞移植應(yīng)用的有效途徑之一。

有研究報(bào)道，黃芩苷可清除活性氧成分、超氧自由基，起到抗氧化的作用，同時(shí)對(duì)于抗凋亡也有作用［3-4］。而細(xì)胞衰老的過程中，活性氧成分和超氧自由基積累增多是重要的原因之一［2］。但是黃芩苷對(duì)于老年骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBM-MSCs） 的作用目前還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究黃芩苷對(duì)于老年hBM-MSCs增殖能力和凋亡水平的作用，為改善老年干細(xì)胞自體移植治療提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 黃芩苷（西安原生植物技術(shù)有限公司，純度 98%）。Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium（IMDM）細(xì)胞培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清（Gibco，美國）；0.25%胰酶（索萊寶，中國）；CCK-8試劑盒（Dojindo，日本）；Bcl-2、Bax一抗（Santa Cruz，美國）；ACTB、caspase 3一抗（Cell Signaling Technology，美國）；辣根標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中杉，中國）；高靈敏度化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（漢恒生物科技，中國）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）；DUB00型核酸蛋白分析儀（Beckman Coulter公司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 老年hBM-MSCs的培養(yǎng) 取自山西醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院血液科（排除惡性腫瘤）8例老年患者骨髓，55～81歲，平均年齡（63.23±2.71）歲。本研究已經(jīng)通過山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查（批件號(hào)2019LL186），受試者均簽署知情同意書。獲得骨髓后，將新鮮的骨髓1 mL中加入10 mL含有10%FBS IMDM培養(yǎng)基中，接種到100 mm2的培養(yǎng)皿中，48 h后換液培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80～90%融合時(shí)，將細(xì)胞以5000細(xì)胞/cm2的密度傳代。本實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞均為P4代細(xì)胞。

1.2.2 CCK-8法檢測黃芩苷的細(xì)胞毒性 本實(shí)驗(yàn)用CCK-8試劑盒檢測黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs的細(xì)胞毒性作用。將老年hBM-MSCs分為8個(gè)濃度，每個(gè)濃度 3個(gè)復(fù)孔（分別為0 μM/L、0.5 μM/L、1 μM/L、10 μM/L、50 μM/L、100 μM/L、500 μM/L、1000 μM/L）以1000細(xì)胞/孔的密度分別接種到96孔板中，加入含10%FBS IMDM培養(yǎng)基中貼壁過夜后，換液為不同濃度黃芩苷（0、0.5、1、10、50、100、500、1000μM/L）+10%FBSIMDM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光值（A值），每例細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔，取均值代表細(xì)胞毒性，參比波長為600 nm。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞的增殖能力 將老年hBM-MSCs分為4個(gè)濃度，每個(gè)濃度8例細(xì)胞，每例細(xì)胞每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔（分別為0 μM/L、0.5μM/L、1 μM/L、10 μM/L） 以 7000 細(xì)胞/孔的密度接種到12孔板中，分別加入黃芩苷濃度為0、0.5、1、10 μM/L 的 10%FBS IMDM 培養(yǎng)基，在培養(yǎng) 0、2、4、6、8 d 后，用 0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.4 Annexin-V和PI染色法檢測細(xì)胞的凋亡水平 將老年hBM-MSCs分為兩組（對(duì)照組和黃芩苷組，每組8例細(xì)胞，每例細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔），將細(xì)胞以 105/mL 的密度接種，分別加入含 0 μM/L、1 μM/L黃芩苷的培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)至6 d時(shí)，收集細(xì)胞用 1000 μM H2O2處理 6 h，用 Annexin-V 和 PI染色（Life Technologies），流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平，凋亡細(xì)胞為Annexin-V陽性細(xì)胞。

1.2.5 Western免疫印跡法檢測Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白相對(duì)水平的表達(dá) 將老年hBM-MSCs分為兩組（對(duì)照組和黃芩苷組，每組8例細(xì)胞，每例細(xì)胞3個(gè)復(fù)孔），將細(xì)胞以1×105/mL的密度接種，分別加入含 0 μM/L、1 μM/L 黃芩苷的培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)至6 d時(shí)，收集細(xì)胞用1000 μM/L H2O2處理6 h后，用RIPA蛋白裂解液提取對(duì)照組和黃芩苷組細(xì)胞的總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取30 μL蛋白經(jīng)12%SDS凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加5%脫脂牛奶4℃封閉過夜后，分別加入一抗兔抗人 Bax（1∶200）、一抗兔抗人Bcl-2（1∶200）、一抗兔抗人 cleaved caspase 3（1∶1000）、一抗鼠抗人 ACTB（1∶1000），4 ℃過夜孵育，加入1∶2000辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后加入ECL顯影液，用圖像分析系統(tǒng)采圖，Image J軟件以ACTB為內(nèi)參分析相對(duì)灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白灰度值/ACTB灰度值。

1.2.6 SOD和MDA含量的測定 將以上1.2.5處理的細(xì)胞用細(xì)胞刮收集，清洗離心后超聲粉碎，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒和丙二醛（MDA）檢測試劑盒說明書檢測SOD和MDA的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t-test檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷的細(xì)胞毒性

本實(shí)驗(yàn)用CCK-8法檢測黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs的細(xì)胞毒性。用不同濃度的黃芩苷（0.1-1000 μM/L）處理老年 hBM-MSCs。從實(shí)驗(yàn)中觀察到，當(dāng)用含有 0.5、1、10 μM/L 黃芩苷的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞3 d時(shí)呈現(xiàn)最小細(xì)胞毒性。而在培養(yǎng)基中黃芩苷濃度大于50 μM/L時(shí)，細(xì)胞的存活率與對(duì)照組比較（IMDM培養(yǎng)基中黃芩苷濃度為0 μM/L）均明顯下降（P＜0.01），出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒性表現(xiàn)（圖1）。因此黃芩苷對(duì)干細(xì)胞增殖能力實(shí)驗(yàn)中所用黃芩苷濃度為0.5、1、10 μM/L。

圖1 黃芩苷（baicalin）對(duì)老年hBM-MSCs的細(xì)胞毒性

2.2 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs增殖能力的影響

本實(shí)驗(yàn)通過計(jì)數(shù)法研究發(fā)現(xiàn)（圖2）：與對(duì)照組（0 μM/L）比較，在第 2天和第 4天，3個(gè)不同濃度黃芩苷組老年hBM-MSCs的數(shù)量沒有顯著差異，但是在第6天和第8天則數(shù)量顯著增多（P＜0.01）。這說明黃芩苷能提高老年hBM-MSCs的增殖能力。其中1 μM/L和10 μM/L黃芩苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力影響較0.5 μM/L黃芩苷的作用更大（P＜0.05）。而 1 μM/L 和 10 μM/L 兩組黃芩處理組之間并無顯著差異。因此以下實(shí)驗(yàn)中所用的黃芩苷的濃度均為1 μM/L。

圖2 黃芩苷（baicalin）對(duì)老年hBM-MSCs增殖能力的影響

2.3 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs凋亡水平的影響

空白組老年hBM-MSCs的凋亡率（Annexin-V陽性細(xì)胞率）為（30.4±4.43）%，黃芩苷組凋亡率（24.9±2.68）%，黃芩苷組的凋亡水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），這說明黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs具有抗凋亡的作用。結(jié)果見圖3。

通過Western印跡法對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)（圖4，表1），與對(duì)照組比較，黃芩苷組clesved caspase 3（caspase 3的裂解產(chǎn)物）和促凋亡蛋白Bax蛋白水平表達(dá)下降，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響 （±s）

表1 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05

Group n Bax Cleaved caspase 3 Bcl-2 Control group 8 1.204±0.214 0.375±0.012 0.734±0.291 Baicalin group 8 0.433±0.1051） 0.122±0.0331） 1.539±0.2391）

2.4 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs中SOD和MDA含量的影響

圖3 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs凋亡水平的影響

圖4 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase 3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，超氧化物歧化酶（SOD）的含量顯著增高（P＜0.05），而丙二醛的含量則顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影響（±s）

表2 黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.05

Group n SOD（U/mg） MDA（nmol/mg）Control group 8 72.30±14.32 5.05±1.09 Baicalin group 8 97.86± 0.1051） 2.94±0.831）

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其來源豐富、取材方便、低免疫性等優(yōu)勢成為干細(xì)胞最主要的來源之一。研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長，hBM-MSCs呈現(xiàn)出衰老的表型，增殖能力和抗氧化應(yīng)激能力均下降，凋亡水平升高。因此老年hBM-MSCs自體移植的應(yīng)用在很多領(lǐng)域受到了局限［3，5］。隨著全球人口老齡化時(shí)代的到來，如何使老年hBM-MSCs更加年輕化，使其增殖能力和抗氧化應(yīng)激能力提高、凋亡水平下降，從而提高修復(fù)能力、改善老年hBMMSCs自體移植治療效果日益重要。

黃芩（baicalin，C21H18O11），別名黃芩苷，化學(xué)名為5，6-二羥基-7-O-葡萄糖醛酸黃酮苷，是從黃芩根中提取出來的一種黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性，并且毒性低、安全范圍廣，藥物來源方便且豐富（黃芩為山西的道地藥材之一），具有廣闊的發(fā)展前景。大量的研究發(fā)現(xiàn)：黃芩苷具有抗氧化應(yīng)激的作用，黃芩苷在結(jié)腸炎、鎘誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性、缺血-再灌注后的心肌損傷和腦外傷的應(yīng)用中均表現(xiàn)出保護(hù)作用，而這些保護(hù)作用都是通過抗氧化應(yīng)激作用來實(shí)現(xiàn)的［3-4，6-7］。氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞衰老過程中的關(guān)鍵步驟之一［2］，但是目前對(duì)于黃芩苷對(duì)hBM-MSCs的作用國內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究以黃芩苷為靶點(diǎn)，探討使老年hBM-MSCs年輕化的方法。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：將1 μM/L的黃芩苷作用于H2O2誘導(dǎo)的老年hBMMSCs，使脂質(zhì)過氧化物MDA表達(dá)下降，過氧化物歧化酶 SOD 表達(dá)升高，與研究報(bào)道一致［3-4，6-7］。因此我們得出結(jié)論：黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs具有抗氧化應(yīng)激作用，黃芩苷可能是老年hBM-MSCs年輕化的靶點(diǎn)。

本研究首先進(jìn)行黃芩苷對(duì)老年hBM-MSCs的毒性作用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)用含有 0.5、1、10 μM/L黃芩苷的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)老年hBM-MSCs時(shí)呈現(xiàn)最小細(xì)胞毒性。因此本研究在做細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別用0.5、1、10 μM/L的黃芩苷作用于老年hBM-MSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：黃芩苷可以促進(jìn)老年hBM-MSCs的增殖能力。1、10 μM/L的黃芩苷作用于老年hBM-MSCs，其增殖能力高于0.5 μM/L。而1 μM/L與10 μM/L黃芩苷作用于老年hBMMSCs，其增殖能力沒有顯著差異，因此將1 μM/L的黃芩苷作為最適濃度。Zuo Wenpu等［8］研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)于施萬細(xì)胞有促進(jìn)其增殖能力的作用。李蓉等［9-10］研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，從而改善缺血再灌注損傷后的認(rèn)知和記憶功能的障礙。但是也有部分研究與本研究結(jié)果相反，Wang Jian等［11］發(fā)現(xiàn)黃芩苷通過抑制miR-294的表達(dá)抑制小鼠胚胎干細(xì)胞的增殖。通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)：上述研究黃芩苷濃度均在100 μM/L以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本實(shí)驗(yàn)中所使用的濃度，這可能是產(chǎn)生結(jié)果不一致的原因之一，也有可能是細(xì)胞種類的不同、實(shí)驗(yàn)條件的不同等，但這些都有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

Fang Jiang等［3］研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗凋亡的作用：于腦外傷的小鼠腹腔注射黃芩苷后，全腦凋亡陽性細(xì)胞減少，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax和caspase 3表達(dá)下降。Yao Jun等［4］發(fā)現(xiàn)黃芩苷作用于結(jié)腸炎大鼠模型，可以使結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞減少，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax和TGF-β表達(dá)下降。本研究結(jié)果證實(shí)：黃芩苷作用于老年hBM-MSCs后，凋亡細(xì)胞陽性率下降，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，促凋亡蛋白Bax和caspase 3表達(dá)下降。

綜上所述，黃芩苷具有促進(jìn)老年hBM-MSCs呈現(xiàn)出年輕化的表現(xiàn)，即增殖能力增強(qiáng)，凋亡水平下降，而這些作用可能是通過修復(fù)抗氧化應(yīng)激能力實(shí)現(xiàn)的，本研究為改善老年干細(xì)胞自體移植治療效果提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。