朱丹丹　洪輝　吳紅宇　吳芝岳　辛正杰

摘 要：本研究以食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中乳鐵蛋白的測(cè)定（征求意見(jiàn)稿）》為參考，優(yōu)化預(yù)處理步驟和梯度洗脫條件，建立了一種用紫外高效液相色譜測(cè)定特殊用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量的方法。色譜柱為C4，5 μm，300A，250 mm×4.6 mm，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。結(jié)果表明，乳鐵蛋白的檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g，在乳鐵蛋白濃度為10～140 μg·mL-1范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果呈良好線性關(guān)系，回收率在98%～105%。用此方法檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度高，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞：乳鐵蛋白;高效液相色譜法;特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品;紫外檢測(cè)器

Abstract：This study was based on the national food safety standards food on the determination of lactoferrin， optimizing the pretreatment steps and gradient elution conditions， establishing a method with a HPLC to determin the lactoferrin containingin infant special medical purposes formula food Chromatographic conditions： the chromatographic column was C4， 5 μm， 300A， 250 mm×4.6 mm， the mobile phase A was acetonitrile， the mobile phase B was 0.1% trifluoroacetic acid， and the detection wavelength was 280 nm. The results showed that the detection limit of lactoferrin was 2.5 mg/100 g， and the determination limit was 4.0 mg/100 g which is in the range of lactoferrin concentration of 10～140μg·mL-1. The detection results showed a good linear relationship， and the recovery rate was 98%～105%. The method on determining lactoferrin content in infant formula has more convenient operation， higher precision， higher accuracy and better repeatability.

Key words：Lactoferrin; HPLC; Formula foods for infants and young children for special medical purposes; Ultraviolet detector

中圖分類號(hào)：O657.72

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品，市場(chǎng)購(gòu)買;乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），購(gòu)自北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司;乙腈（CH3CN，色譜純，含量≥99.8%），購(gòu)自美國(guó)天地試劑公司;磷酸氫二鈉（Na2HPO4，含量≥99.0%）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4，含量≥99.0%）、氯化鈉（NaCl，含量≥99.5%）、氯化鉀（KCl，含量≥99.5%），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸（HCl，含量≥99.5%），購(gòu)自浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司;三氟乙酸（CF3CO2H，含量≥99.0%），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn);MS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn);pH計(jì)（精度為0.01），瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn);TGL-16M冷凍離心機(jī)，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);XW-80A渦旋混合器，上海醫(yī)大儀器有限公司生產(chǎn);C4色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司生產(chǎn);乳鐵蛋白肝素免疫親和柱，北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司生產(chǎn);0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

樣品中的乳鐵蛋白經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，肝素親和柱凈化后，利用C4色譜柱分離，于280 nm波長(zhǎng)處紫外檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

1.2.2 試劑配制

（1）磷酸鹽緩沖溶液。稱取8.00 g氯化鈉、2.92 g

十二水磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，再加水至1 000 mL。

（2）結(jié)合緩沖液。稱取30.083 g十二水合磷酸氫二鈉，2.496 g二水合磷酸二氫鈉，加入20 mL試劑A（50×濃縮液），加入900 mL水溶解，最后定容至1 000 mL。試劑A為升級(jí)后此款肝素親和柱配套使用溶液，升級(jí)后產(chǎn)品測(cè)得回收率更高。

（3）洗脫液。稱取7.52 g十二水合磷酸氫二鈉、0.624 g二水合磷酸二氫鈉、29.2 g氯化鈉，加入400 mL水溶解，最后定容至500 mL。

（4）0.1%三氟乙酸溶液。取三氟乙酸1.00 mL，用水定容至1 000 mL，搖勻，過(guò)0.22 μm濾膜，超聲后備用。

如果磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為無(wú)水，需要進(jìn)行折算。

1.2.3 樣品處理

（1）提取。稱取3 g（精確至0.01 g）樣本于50 mL螺口塑料離心管中，先加入約30 mL結(jié)合緩沖液渦旋振蕩至樣本充分溶解，再加入結(jié)合緩沖液定容至刻度，混勻。于4 ℃，9 800 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下離心20 min，離心后輕輕取出中間層，上層有脂質(zhì)，下面有沉淀，用大量程的移液器將中間液體部分吸出，注意不要吸取上層脂質(zhì)和下面沉淀。取其中的10～15 mL作為上樣液。

（2）凈化。取出肝素親和柱，注射器針筒直接穿透柱塞，連接肝素親和柱，去掉親和柱下方堵頭，加壓排出柱內(nèi)的保存液，待柱內(nèi)保存液與篩板齊平后，取5 mL結(jié)合緩沖液平衡親和柱。

（3）上樣。待結(jié)合緩沖液液面接近篩板后取凈化步驟處理完畢后樣品提取液15 mL過(guò)柱（若樣本量大可分次加入，用SPE流速調(diào)節(jié)閥控制上樣流速，約0.3 mL·min-1），棄去全部流出液。

（4）淋洗。待樣品提取液加完，液面與篩板齊平后，加10 mL結(jié)合緩沖液，進(jìn)行親和柱的洗雜。

（5）洗脫。進(jìn)行洗雜后，排干柱內(nèi)結(jié)合緩沖液，向肝素親和柱內(nèi)加入4 mL洗脫緩沖液，靠重力流速滴出，流速≤1滴/s，收集全部洗脫液，并定容至4 mL，將收集液過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)樣。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 000 μg·mL-1）：在已購(gòu)買的10 mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品小瓶中準(zhǔn)確加入1.00 mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻1 min。該標(biāo)準(zhǔn)溶液在-20 ℃下可保存6個(gè)月。

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 000 μg·mL-1）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液50 μL于進(jìn)樣小瓶中，再準(zhǔn)確加入450 μL結(jié)合液渦旋混勻。該標(biāo)準(zhǔn)工作液在0～4 ℃冰箱中可保存2周。

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液10、30、50、70 μL和140 μL于5個(gè)進(jìn)樣小瓶中，再分別加入990、970、950、930 μL和860 μL洗脫緩沖液，渦旋混勻，得到10～140 μg·mL-1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做曲線回歸方程。

乳鐵蛋白含量計(jì)算：

（1）

式（1）中，W-乳鐵蛋白含量，單位為mg/100 g;ρ-樣液檢測(cè)濃度，單位為μg·mL-1;4-洗脫體積，單位為mL;V-定容體積，單位為mL;15-上樣體積，單位為mL;m-樣品稱樣量，單位為g;1 000-濃度單位換算系數(shù);n-稀釋倍數(shù)。

1.2.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry300tm C4 5μm，4.6×250 mm

Column;柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積30 μL;流速

1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈。流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及標(biāo)準(zhǔn)品

將濃度為10、30、50、70 μg·mL-1和140 μg·mL-1工作液分別進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作曲線回歸方程。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.878 1x-14.337 4，

線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見(jiàn)圖2，樣品圖譜見(jiàn)圖3。

2.2 檢出限和定量限

依據(jù)藥典2010版第二部附錄XIX A《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，認(rèn)為信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度為方法檢出限，信噪比為10∶1相應(yīng)濃度為方法定量限。從曲線最低點(diǎn)開(kāi)始分別稀釋至1、3、5、7 μg·mL-1和9 μg·mL-15個(gè)濃度，分別得到信噪比約為0.86、3.35、9.08、14.49和21.49，故認(rèn)為本方法的檢出限為3 μg·mL-1，定量限為5 μg·mL-1。用公式

（1）換算得到相應(yīng)乳鐵蛋白含量，

（2）

式（2）中：X-試樣中乳鐵蛋白的含量，單位mg/100 g;C-待測(cè)液中乳鐵蛋白的濃度，單位μg·mL-1;3.5-洗脫液體積;V-定容體積;15-上樣液體積;m-稱樣量，單位g。計(jì)算檢出限時(shí)稱樣量以3 g計(jì)，定容體積為100 mL。

故本研究中乳鐵蛋白檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g。

2.3 方法回收率

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》

（GB/T 27404-2008）的要求，結(jié)合實(shí)際檢測(cè)樣品中的乳鐵蛋白含量以及親和柱的柱容量，對(duì)樣品進(jìn)行3水平的加標(biāo)測(cè)定，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)?；厥章试?8%～105%，表明本方法準(zhǔn)確度較高。加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 方法精密度

利用特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品同一天進(jìn)行同一樣品進(jìn)行6個(gè)平行試驗(yàn)，RSD結(jié)果1.61%，小于10%，表明本方法的精密度較好，測(cè)定見(jiàn)表3。

2.5 方法重現(xiàn)性

對(duì)同一批特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品分別進(jìn)行6次獨(dú)立測(cè)定，RSD結(jié)果小于10%，表明本方法的重現(xiàn)性較好。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3 結(jié)論

本方法采用肝素免疫親和柱凈化，C4色譜柱分離，外標(biāo)法定量。初步建立了一種準(zhǔn)確、高效的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明：在10～140 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g，平均回收率為102%，同一天同一樣品檢測(cè)結(jié)果RSD為1.61%，耐受性實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)果的RSD為3.58%。各數(shù)據(jù)均符合相應(yīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，且結(jié)果良好，能滿足目前大部分市面上嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量測(cè)定。