郭啟勇，陶金忠，吳心華，郭延生

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

奶牛在圍產(chǎn)期經(jīng)歷了妊娠、分娩和泌乳的巨大生理變化[1-3]。奶牛產(chǎn)后對營養(yǎng)元素的需要迅速增高，日糧攝入的營養(yǎng)元素不能滿足奶牛產(chǎn)后營養(yǎng)需要，使奶牛發(fā)生能量負平衡(negative energy balance,NEB)[1]。NEB導(dǎo)致血糖水平降低，并動員機體提供額外能量，致使血液中非酯化脂肪酸(NEFA)和β-羥基丁酸(BHBA)濃度升高[2]，B細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白減少[3]。高濃度的NEFA與BHBA對血液中性粒細胞功能產(chǎn)生免疫抑制的作用,增加了奶牛對外界病原微生物的易感性[4]。近年來，隨著國家減抗、限抗政策的不斷升級，開發(fā)臨床效果好、無毒和無殘留的中獸藥制劑成為當(dāng)前獸藥研發(fā)的熱點[5]。歸芪益母口服液是在中獸醫(yī)經(jīng)典古方歸芪益母散的基礎(chǔ)上研發(fā)的新的中獸藥制劑。歸芪益母散出自于清代沈蓮舫《牛經(jīng)備要醫(yī)方》，由黃芪、當(dāng)歸和益母草組成。具有補氣生血、活血化瘀之功效，可用于促進同期發(fā)情，治療產(chǎn)科疾病(子宮積液、不孕癥、產(chǎn)后癱瘓等)[6]。有研究表明歸芪益母散能顯著降低圍產(chǎn)后期奶牛血液中的白細胞數(shù),增加產(chǎn)后血液紅細胞的數(shù)量,提高血紅蛋白和血小板的含量[7]。目前關(guān)于歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛免疫機能和生產(chǎn)性能的研究未見報道，因此本試驗以免疫機能和生產(chǎn)性能為評價指標(biāo)，探討歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛保健與疾病防治的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和材料FACSEALIBUR流式細胞儀購自美國BD公司；Fossomatic FC 全自動乳體細胞分析儀購自丹麥福斯電器公司 ；IgM、IgG、IgA酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；歸芪益母口服液，愛迪森(北京)生物科技有限公司提供，生產(chǎn)批號：130806。

1.2 實驗動物分組與處理選擇2～4胎次荷斯坦產(chǎn)后奶牛40頭，隨機分為4組，每組10頭，低、中、高劑量組分別灌服歸芪益母口服液300，500，800 mL，空白對照組灌服溫開水800 mL，連續(xù)灌服5 d，用藥結(jié)束后繼續(xù)觀察7 d。

1.3 外周血T淋巴細胞亞群檢測分別于產(chǎn)后0，5，12 d 早晨利用含有肝素的抗凝真空采血管進行頸靜脈采血，用流式細胞儀檢測外周血T淋巴細胞CD4+、CD8+，操作方法嚴(yán)格按照儀器操作說明進行。

1.4 血清免疫球蛋白檢測分別于產(chǎn)后0，5，12 d早晨頸靜脈采血，3 000 r/min離心10 min分離血清，用酶聯(lián)免疫法測定各組奶牛血清IgM、IgG和IgA含量，操作方法按照試劑盒操作說明進行。

1.5 生產(chǎn)性能測定記錄各組奶牛用藥前、用藥后和觀察后產(chǎn)奶量，分別于產(chǎn)后0，5，12 d早、中、晚各采集乳樣50 mL，按4∶3∶3比例混合后，檢測乳成分和體細胞數(shù)，操作方法按照全自動乳體細胞分析儀操作說明進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以x±s表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛血清免疫球蛋白的影響IgA：由表1可見，用藥前、用藥后與觀察后各組之間差異均不顯著(P>0.05)，各組用藥前、用藥后與觀察后之間差異均不顯著(P>0.05)。

IgM：由表1可見，用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)，用藥后和觀察后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于空白對照組與低劑量組(P<0.05)，空白對照組與低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)?？瞻讓φ战M用藥后略高于用藥前(P>0.05)，其余3組用藥后明顯高于用藥前(P<0.05)；各組觀察后略高于用藥后，但差異不顯著(P<0.05)。表明產(chǎn)后奶牛隨時間延長血清IgM略有升高，不同劑量的歸芪益母口服液具有一定的促進作用，但以中劑量和高劑量效果最好，但中、高劑量組之間差異不顯著。

IgG：由表1可見，用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后和觀察后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于空白對照組和低劑量組(P<0.05)，空白對照組與低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)。各組用藥后均明顯高于用藥前(P<0.05)，其中空白對照組與低劑量組觀察后顯著高于用藥后(P<0.05)，其余2組觀察后與用藥后組間差異不顯著(P>0.05)。表明產(chǎn)后血清IgG含量隨康復(fù)時間顯著升高，中、高劑量歸芪益母口服液具有顯著促進作用，但兩劑量組之間無顯著性差異。

表1 不同劑量歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛IgA、IgM、IgG含量的影響(x±s，n=10) g/L

綜上，中、高劑量歸芪益母口服液可顯著提高產(chǎn)后奶牛血清IgM和IgG的含量，但兩劑量組之間無明顯差異。

2.2 歸芪益母口服液對外周血淋巴細胞亞群CD4+、CD8+及其比值的影響CD4+：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于低劑量組(P<0.05)，低劑量組明顯高于空白對照組(P<0.05)；觀察后空白對照組明顯低于其余3組(P<0.05)，其余3組之間差異不顯著(P>0.05)。

空白對照組用藥后明顯低于用藥前(P<0.05)，觀察后明顯低于用藥后(P<0.05)；中劑量組用藥后與觀察后之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于用藥前(P<0.05)；高劑量組用藥后顯著高于用藥前與觀察后，用藥前與觀察后差異不顯著(P>0.05)(表2)。說明產(chǎn)后奶牛隨時間延長外周血CD4+含量呈降低趨勢，不同劑量歸芪益母口服液有增加外周血CD4+含量的作用，以中、高劑量效果最好，但中、高劑量組之間無顯著性差異。

CD8+：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后和觀察后空白對照組和低劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于中、高劑量組(P<0.05)，中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。

空白對照組和低劑量組用藥后明顯高于用藥前(P<0.05)；中、高劑量組用藥后與用藥前相比差異不顯著(P>0.05)(表2)。說明產(chǎn)后奶牛外周血淋巴細胞亞群CD8+含量隨恢復(fù)時間延長呈上升趨勢，中、高劑量歸芪益母口服液有減緩?fù)庵苎馨图毎麃喨篊D8+上升的作用，但兩劑量組之間差異不顯著。

CD4+/CD8+：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后高劑量組略高于中劑量組(P>0.05)，中劑量組明顯高于低劑量組(P>0.05)，低劑量組明顯高于空白對照組(P<0.05)(表2)。

空白對照組和低劑量組用藥后明顯低于用藥前(P<0.05)，中、高劑量組用藥后略低于用藥前(P>0.05)；中、高劑量組觀察后均明顯低于用藥后(P<0.05)，其余2組觀察后與用藥后之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。說明產(chǎn)后奶牛外周血淋巴細胞亞群CD4+/CD8+比值隨時間延長逐漸呈下降趨勢，不同劑量歸芪益母口服液具有減緩產(chǎn)后奶牛外周血淋巴細胞亞群CD4+/CD8+比值升高的作用，但以中、高劑量效果最好，但中、高劑量組之間相比差異不顯著。

表2 歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛外周血CD4+、CD8+及其比值的影響(x±s，n=10) %

綜上，產(chǎn)后奶牛隨著時間的延長，外周血淋巴細胞亞群CD4+含量逐漸降低，CD8+含量逐漸升高，以致CD4+/CD8+比值逐漸降低，中、高劑量歸芪益母口服液具有顯著的拮抗作用，兩劑量組相比，拮抗效果差異不顯著。

2.3 歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛產(chǎn)奶量和乳成分的影響日產(chǎn)奶量：用藥前各組之間差異不顯著(P>0.05)；用藥后和觀察后中、高劑量組之間差異不顯著(P>0.05)，但明顯高于低劑量組和空白對照組(P<0.05)。各組用藥后均顯著高于用藥前(P<0.05)，觀察后均顯著高于用藥后(P<0.05)(表3)。表明產(chǎn)后奶牛隨時間延長，產(chǎn)奶量呈逐漸增高趨勢，中、高劑量歸芪益母口服液能顯著促進產(chǎn)后奶牛產(chǎn)奶量的升高，但中、高劑量組之間相比差異不顯著。

乳脂率、蛋白率和乳糖：各組用藥前、用藥后、觀察結(jié)束后之間差異均不顯著(P>0.05)(表3)。表明產(chǎn)后各試驗階段乳脂率、蛋白率和乳糖無顯著變化，歸芪益母口服液也對產(chǎn)后奶牛乳脂率、蛋白率和乳糖的變化無影響。

體細胞數(shù)：用藥前各組差異不顯著(P>0.05)；用藥后空白對照組明顯高于低、中、高劑量組(P<0.05)，低、中、高劑量之間差異不顯著(P>0.05)。各組用藥后均較用藥前明顯降低(P<0.05)，觀察后均較用藥后明顯降低(P<0.05)(表3)。表明產(chǎn)后奶牛體細胞數(shù)均較高，但隨著身體機能的逐漸恢復(fù)，體細胞呈降低趨勢，不同劑量歸芪益母口服液能促進產(chǎn)后奶牛體細胞數(shù)的降低，減少患乳房炎的潛在風(fēng)險，但低、中、高劑量組之間相比差異不顯著。

表3 不同劑量歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛生產(chǎn)性能指標(biāo)的影響(x±s，n=10)

3 討論

3.1 歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛免疫球蛋白的影響根據(jù)最新的研究表明，歸芪益母口服液通過黃芪、益母草中的槲皮素、山奈酚、芒柄花黃素、花生四希酸、異鼠李素,當(dāng)歸中的β-谷固醇和豆甾醇發(fā)揮作用[8]。槲皮素的分子式C15H10O7，具有一定的抗炎和抗氧化的作用，減輕炎性細胞浸潤，改善肝臟代謝[9]。山奈酚具有抗菌消炎、提高免疫力的作用[10]。芒柄花黃素是一種具有類雌二醇分子結(jié)構(gòu)的異黃酮類植物雌激素，通常具有清除自由基、抗癌、促進雌激素分泌，研究表明對前列腺、乳腺、子宮均有促進發(fā)育和修復(fù)損傷的作用[11]。花生四烯酸是一種長鏈多不飽和酸，在動物的炎癥及免疫反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用,在營養(yǎng)物質(zhì)代謝、白細胞功能調(diào)控和血小板激活中也發(fā)揮作用[12]，并通過細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶反應(yīng)等方式調(diào)控機體穩(wěn)態(tài)[13]。異鼠李素能夠促進淋巴細胞增殖[14]，其機制可能與改善細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)、線粒體功能、降低Cyt-c和Caspase-9蛋白表達等線粒體凋亡通路相關(guān)指標(biāo)有關(guān)[15]。β-谷固醇具有一定的抗炎解熱鎮(zhèn)痛和促進前列腺素的釋放作用[16]。β-谷固醇是一種強抗氧化劑，尤其對脂質(zhì)氧化的抑制程度很高[17]。

免疫球蛋白是機體抵御外界病原微生物侵入的防線，存在于血液和其他體液中，有特異性識別和結(jié)合抗原的能力[18]，是抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生的免疫球蛋白[19]，主要分布于血清中。對于維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和體液免疫應(yīng)答至關(guān)重要。這種抗體與自身抗原和入侵的病原體結(jié)合，清除凋亡細胞和其他細胞碎片，并引發(fā)體液免疫[20]。分泌型IgA主要分布在鼻、咽、氣管、腸和膀胱黏膜的表面，是機體黏膜防御系統(tǒng)的主要成分[21]。其能抑制微生物黏膜表面附著，減緩病毒繁殖，對抗外來抗原進入呼吸道或消化道；局部免疫系統(tǒng)遭到刺激后，無需中央免疫系統(tǒng)的參與，直接參與免疫應(yīng)答[22-23]。奶牛產(chǎn)后處于NEB狀態(tài)[24]，圍產(chǎn)期奶牛內(nèi)分泌、營養(yǎng)代謝和生理狀態(tài)的變化，促使奶牛產(chǎn)后免疫力低下[25]，容易受到病原微生物的侵入，加大產(chǎn)后感染性疾病發(fā)生的概率[26]。

本試驗結(jié)果顯示，奶牛產(chǎn)后12 d內(nèi)血清IgA變化不顯著，但IgM、IgG逐漸升高，說明奶牛圍產(chǎn)期免疫受到抑制[27]，但隨著恢復(fù)時間延長，免疫能力逐漸恢復(fù)[28]，而中、高劑量組歸芪益母口服液可顯著提高產(chǎn)后奶牛血清IgM和IgG的含量，有助于產(chǎn)后奶牛免疫力的恢復(fù)。

3.2 歸芪益母口服液對外周血淋巴細胞亞群及其比值的影響CD4+和CD8+的比值是評價機體免疫功能是否平衡的重要指標(biāo)，當(dāng)CD4+和CD8+細胞的數(shù)量異?；虮壤д{(diào)時，T淋巴細胞調(diào)節(jié)功能就會失去平衡[29-31]。當(dāng)發(fā)生細菌感染時，效應(yīng)性T淋巴細胞增多，這與CD8+升高密切相關(guān)[31]。對抗細菌感染時，CD8+能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[32-33]。有研究表明，在正常情況下，牛CD4+/CD8+比值在2.5～4.0[34]。研究顯示葡萄球菌感染的奶牛，乳汁中CD8+增高，抑制CD4+的增殖[35]。另有研究指出奶牛圍產(chǎn)期發(fā)生感染性疾病的原因，與淋巴細胞亞群的改變有關(guān)[36]。在本試驗中，對照組奶牛外周血CD8+呈上升趨勢，說明產(chǎn)后奶牛免疫機能失調(diào)，存在不同程度的感染[37-38]，而CD4+與CD4+/CD8+的比值均出現(xiàn)了不同程度的降低，這可能與CD8+活化有關(guān)[39-40]。不同劑量組歸芪益母口服液均能不同程度提高CD4+的數(shù)量，中、高劑量歸芪益母口服液能顯著提高CD4+的數(shù)量。不同劑量組歸芪益母口服液組用藥后CD8+同對照組一樣，出現(xiàn)不同程度的增加，但低劑量歸芪益母口服液組增加明顯，而中、高劑量組增加不明顯，說明中、高劑量歸芪益母口服液組奶牛感染病原微生物的幾率低于低劑量組。對照組CD4+/CD8+比值隨時間延長逐漸呈下降趨勢，不同劑量歸芪益母口服液具有減緩產(chǎn)后奶牛CD4+/CD8+比值下降的作用，但以中、高劑量效果最好，中、高劑量之間相比差異不顯著。綜上可見產(chǎn)后奶牛隨恢復(fù)時間延長，CD4+含量逐漸降低，CD8+含量逐漸升高，以致CD4+/CD8+比值逐漸降低，中、高劑量歸芪益母口服液對外周血淋巴細胞亞群具有一定的拮抗作用。

3.3 歸芪益母口服液對產(chǎn)后奶牛生產(chǎn)性能的影響奶牛一旦產(chǎn)后發(fā)生營養(yǎng)代謝病或乳房炎，產(chǎn)奶量損失可達20%～70%，甚至個別奶牛將會無法泌乳，面臨被動淘汰[41]。奶牛生產(chǎn)性能主要包括產(chǎn)奶量、乳成分和體細胞數(shù)，對生產(chǎn)性能的測定，可以預(yù)測奶牛的健康狀況，有效預(yù)防牛群疾病的發(fā)生[42]。產(chǎn)奶量是衡量奶牛泌乳性能的重要指標(biāo)[43-44]。本試驗在相同的日糧水平和飼養(yǎng)管理水平下，中、高劑量歸芪益母口服液組顯著提高產(chǎn)奶量。這可能與歸芪益母口服液糾正奶牛產(chǎn)后能量負平衡和減少病原微生物感染有關(guān)。奶牛在60 d產(chǎn)奶周期內(nèi)，試驗組奶牛產(chǎn)奶量一直高于對照組，說明歸芪益母口服液對于延長產(chǎn)奶周期有一定的作用。歸芪益母口服液里面的芒柄花黃素和槲皮素均有促進雌激素分泌的作用，產(chǎn)奶量的提高可能與芒柄花黃素和槲皮素的作用有關(guān)。

牛奶體細胞數(shù)(somatic cell count,SCC) 是指每毫升牛奶中體細胞總數(shù)，SCC是反映奶牛健康的一個重要指標(biāo)，SCC通常是指乳腺脫落的上皮細胞和參與機體免疫的淋巴細胞[45-46]。當(dāng)乳腺受到外傷或者發(fā)生感染時SCC數(shù)量就會增加[47]，測定SCC變化有助于及早發(fā)現(xiàn)乳房損傷或感染(如乳房炎)，預(yù)防和治療乳房炎[48]。研究發(fā)現(xiàn)SCC的變化與產(chǎn)奶量和其他乳成分密切相關(guān)，奶牛在患乳房炎時，乳腺細胞受到破壞，導(dǎo)致乳腺分泌機能障礙，SCC升高產(chǎn)奶量減少[49]。本試驗結(jié)果顯示，產(chǎn)后奶牛SCC數(shù)量均較高，但隨著身體機能的逐漸恢復(fù)，SCC呈降低趨勢，不同劑量歸芪益母口服液能降低產(chǎn)后奶牛的SCC，減少患乳房炎的潛在風(fēng)險，這與歸芪益母口服液能夠提高產(chǎn)后奶牛免疫力密切相關(guān)。

本試驗結(jié)果表明，中、高劑量歸芪益母口服液能顯著提高產(chǎn)后奶牛IgM、IgG、CD4+、CD4+/CD8+含量，降低CD8+含量，顯著提高產(chǎn)奶量，降低SCC，減少患乳房炎的潛在風(fēng)險。