吳 飛，沈朋雷，王露露，陳維麗，馮萬有，俸 云，盧嘉卡，陸鳳花，石德順

(廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004)

卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)是將卵巢卵泡中的未成熟卵子取出，放在模擬體內(nèi)卵泡環(huán)境的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，使卵母細(xì)胞達(dá)到成熟階段并具有受精能力的技術(shù)。近些年來，卵母細(xì)胞體外成熟過程中的調(diào)控機(jī)制被大量研究，該技術(shù)與體外受精技術(shù)相結(jié)合在動物繁殖領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，并且卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)也被納入人類輔助生殖戰(zhàn)略[1]。在卵泡中，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)之間的結(jié)構(gòu)對卵母細(xì)胞發(fā)育極為重要[2]。卵丘細(xì)胞參與雌配子發(fā)育、減數(shù)分裂以及體外受精等過程。但是，卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞的成熟和受精過程中發(fā)揮的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。在體外成熟過程中，與貓卵母細(xì)胞結(jié)合不緊密的卵丘細(xì)胞并不能提高卵母細(xì)胞的成熟率[3]。兔卵丘細(xì)胞的脫落將導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟率下降[4]。牛卵丘細(xì)胞會分泌雌二醇和孕酮，進(jìn)而參與體外成熟過程[5]，在成熟前，牛COCs中卵丘細(xì)胞的清除會降低卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育到囊胚階段的速度[6]。卵丘細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)控著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，同時卵母細(xì)胞中的分泌因子也會影響卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張。鑒于卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞來自于同一微環(huán)境，且卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞的成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育都極為重要，因此很多學(xué)者通過研究卵丘細(xì)胞的基因表達(dá)來篩選可能預(yù)測胚胎發(fā)育潛能的分子標(biāo)記[7]。

MicroRNAs (miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控RNA，是一種長度約為22個核苷酸的短非編碼RNA，miRNAs通過與靶基因的序列互補(bǔ)配對來降解或抑制mRNA翻譯，調(diào)控靶基因的表達(dá)和翻譯[8-9]。Dicer1是miRNA生物發(fā)生過程中的一個重要核糖核酸酶，其敲除動物模型的建立使得miRNA在卵巢功能中的作用得以闡明。Dicer1基因敲除(KO)導(dǎo)致小鼠早期胚胎致死，表明Dicer1以及miRNA在胚胎發(fā)育中發(fā)揮了重要作用[10]。目前已經(jīng)有30多種miRNA KO的小鼠模型，這其中有11個miRNA被證實(shí)在卵巢功能上有重要作用。然而，并不是所有的KO模型都表現(xiàn)出生殖表型的改變[11]。miR-200b或miR-429缺失的小鼠沒有生殖缺陷，但是當(dāng)這2種miRNA都被缺失時，會導(dǎo)致小鼠不育[12]。沈朋雷等[13]研究發(fā)現(xiàn)相對于水牛GV期卵丘細(xì)胞而言，miRNA-155在MⅡ期卵丘細(xì)胞中顯著上調(diào)，預(yù)示著miRNA-155有可能在卵母細(xì)胞體外成熟過程中發(fā)揮重要作用。而關(guān)于miRNA-155在卵丘細(xì)胞中所起的作用機(jī)制，以及miRNA-155是否會通過作用于卵丘細(xì)胞進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育卻未見報道。

腺病毒載體是目前較為常用的一種載體，其增殖速度快，且基因組信息完全清楚，易于操作，宿主范圍廣，病毒基因組不會整合到宿主DNA中，安全性高。因此，本試驗(yàn)通過構(gòu)建miRNA-155重組腺病毒載體，并在卵丘細(xì)胞上過表達(dá)，為進(jìn)一步研究水牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中miRNA-155在卵丘細(xì)胞中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑水牛卵巢取自南寧市屠宰場，裝入37℃生理鹽水的保溫瓶中，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。用75%酒精清洗30～60 s，37℃生理鹽水清洗2遍，選取直徑2～6 mm卵泡抽取卵泡液，在體視顯微鏡下檢出COCs，體外成熟24 h后，收MⅡ期卵丘細(xì)胞培養(yǎng)備用。

細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、青霉素、鏈霉素及Trizol(Invirtrogen公司)；HEK-293細(xì)胞、HEK-293T細(xì)胞、pDC316-mCMV-EGFP、pBHGloxdelE13cre均由本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ(TaKaRa公司)；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(全式金公司)；去內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒Endo-Free Plasmid Mini Kit 和膠回收試劑盒E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA公司)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑ViaFectTM(Promega公司)；同源重組試劑盒ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，實(shí)時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)試劑盒，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊公司)。

1.2 水牛miRNA-155的克隆及腺病毒載體的構(gòu)建在miRBase中檢索牛pre-miRNA-155序列，并從NCBI中獲取pre-miRNA-155上游200 bp堿基，下游150 bp堿基的初級轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA-155序列，設(shè)計pri-miR-155目的片段擴(kuò)增引物(表1)，由上海生工生物有限公司合成。以水牛卵巢基因組為模板，擴(kuò)增pri-miR-155序列瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收獲得目的產(chǎn)物。使用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ將目的產(chǎn)物和pDC316-mCMV-EGFP分別酶切，膠回收，利用同源重組的方法將目的產(chǎn)物和線性化載體連接，轉(zhuǎn)化、酶切、測序。

1.3 生物信息學(xué)分析利用DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)y序結(jié)果與牛序列進(jìn)行比對。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用TargetScan進(jìn)行靶基因預(yù)測，DAVID獲取靶基因ID，KOBAS 3.0對靶基因ID進(jìn)行KEGG和GO分析，RStudio進(jìn)行KEGG和GO富集分析作圖。

1.4 腺病毒的包裝與擴(kuò)增pBHGloxdelE13cre分別和DC316-mCMV-EGFP-pri-miR-155、pDC316-mCMV-EGFP以2∶1混勻，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑ViaFectTM混合在optim-MEM中，室溫孵育30 min。而后加入到匯合度約70%的HEK-293細(xì)胞中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后更換為DMEM培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)10 d，每天加入0.5 mL培養(yǎng)基。在顯微鏡下觀察細(xì)胞空斑病變，熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況。用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮起，4℃，800 r/min 離心10 min，棄上清，剩余懸液進(jìn)行重懸。在液氮和37℃水中反復(fù)凍融3次，4℃，1 200 r/min 離心10 min，用0.45 μm過濾器過濾后取上清。對包裝好的腺病毒顆粒進(jìn)行3次病毒擴(kuò)增，獲得高濃度Ad-miR-155和Ad-EGFP腺病毒顆粒。

1.5 腺病毒滴度檢測將HEK-293T細(xì)胞接種到96孔板中，每孔接種1×104～1×105個細(xì)胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；10倍倍比稀釋病毒原液后，依次將其加入96孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，根據(jù)感染細(xì)胞中綠色熒光細(xì)胞的陽性數(shù)計算病毒滴度。

1.6 實(shí)時熒光定量分別使用MOI=200的Ad-EGFP和Ad-miR-155感染水牛卵丘細(xì)胞，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。提取RNA，使用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，RT-qPCR檢測miR-155、Wee1、CD44、TRPS1的表達(dá)情況。miR-155反轉(zhuǎn)錄特異性引物、內(nèi)參U6基因及相關(guān)定量引物如表1所示。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-155載體構(gòu)建以卵巢基因組為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增pri-miR-155序列，序列長度為413 bp，并將此序列克隆至pDC316-mCMV-EGFP上，獲得重組質(zhì)粒pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-155。限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ酶切重組質(zhì)粒，凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖1A所示，與預(yù)期片段大小相符，測序結(jié)果和pri-miR-155序列基本吻合(圖1B)。

圖1 載體構(gòu)建結(jié)果 A.M.DL15000 DNA Marker；1.Hind Ⅲ 單酶切產(chǎn)物；B.pri-miR-155測序比對結(jié)果

2.2 物種間pre-miR-155基因同源性比較本試驗(yàn)中水牛pre-miR-155基因與其他14個物種同源性分析結(jié)果顯示，其中水牛pre-miR-155基因與黃牛和馬的同源性最高，達(dá)到100%，與狼、家兔、原雞、樹鼩、獼猴的同源性達(dá)到95%以上，與黑猩猩、褐家鼠、小家鼠、倭黑猩猩、人的同源性也達(dá)到90%以上，而與斑馬魚和爪蟾的同源性最低，分別為58.7%和71.4%；表明水牛pre-miR-155基因在進(jìn)化過程中保守性較強(qiáng)。

2.3 pre-miR-155基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA 7.0軟件對15個物種的miR-155基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示，水牛pre-miR-155基因與哺乳動物獼猴、馬、黃牛、狼、家兔在同一分支上，親緣關(guān)系最為接近，與原雞在相近的分支上，親緣關(guān)系較近，與倭黑猩猩、人、黑猩猩、褐家鼠、小家鼠、樹鼩親緣性較差，形成一個較遠(yuǎn)分支，與斑馬魚和爪蟾親緣性最差，分別形成很遠(yuǎn)的分支(圖2)。

圖2 不同物種間pre-miRNA-155基因的進(jìn)化樹

2.4 miRNA-155預(yù)測靶基因GO富集分析通過對miRNA-155的預(yù)測靶基因進(jìn)行分子組分(圖3)、生物過程(圖4)及細(xì)胞組分(圖5)方面富集分析,可以發(fā)現(xiàn)其預(yù)測靶基因主要富集在細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、蛋白磷酸化、組蛋白甲基化等多個生物學(xué)過程中。作用部位主要是在細(xì)胞核內(nèi)，主要通過與RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)序列特異性結(jié)合發(fā)揮作用。

圖5 miR-155預(yù)測靶基因在細(xì)胞組分(CC)層面富集結(jié)果

圖4 miR-155預(yù)測靶基因在生物過程(BP)層面富集結(jié)果(前20個)

圖3 miR-155預(yù)測靶基因在分子組分(MF)層面富集結(jié)果

2.5 miRNA-155預(yù)測靶基因KEGG富集分析通過Target Scan預(yù)測得到miRNA-155的靶基因共498個，從DAVID中調(diào)取靶基因ID，KOBAS 3.0對靶基因ID進(jìn)行KEGG分析得到208條相關(guān)信號通路，選取前20條信號通路通過RStudio進(jìn)行作圖(圖6)，發(fā)現(xiàn)這些靶基因主要參與MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、mTOR信號通路、cAMP信號通路、T細(xì)胞和B細(xì)胞受體信號通路、癌細(xì)胞和干細(xì)胞信號通路等，這些信號通路主要集中在對細(xì)胞的周期、增殖、凋亡、物質(zhì)代謝等的調(diào)控。

圖6 miRNA-155預(yù)測靶基因KEGG富集散點(diǎn)圖

2.6 重組腺病毒Ad-miR-155包裝及滴度測定pBHGloxdelE13cre和pDC316-mCMV-EGFP-miR-155共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，3 d在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，5 d綠色熒光蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，10 d細(xì)胞從皿底脫落，90%以上的細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá)(圖7)。包裝好的重組腺病毒Ad-miR-155經(jīng)過3輪擴(kuò)增和濃縮之后，梯度稀釋法測得病毒滴度為1×1010GFU/mL。

2.7 RT-qPCR檢測Ad-miR-155和Ad-EGFP感染水牛卵丘細(xì)胞48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察到卵丘細(xì)胞有綠色熒光蛋白的表達(dá)(圖8)。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，Ad-miR-155感染的水牛卵丘細(xì)胞中的miR-155的表達(dá)量顯著高于Ad-EGFP組(P<0.01)，過表達(dá)miR-155后Wee1、CD44、Trps1均顯著下調(diào)(圖9，P<0.01)。

圖8 Ad-miR-155 和Ad-EGFP感染水牛卵丘細(xì)胞熒光檢測結(jié)果

圖9 Ad-miR-155 和Ad-EGFP組miR-155及部分靶基因的表達(dá)水平 **.P<0.01

3 討論

KROL等[14]預(yù)測miRNA調(diào)控哺乳動物至少30%的基因表達(dá)。miRNA與特定靶mRNA的3′ UTR 相結(jié)合，通過轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控對細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)影響[15]。miRNA-155參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡，并且在維持體內(nèi)平衡和免疫系統(tǒng)的功能中起著關(guān)鍵作用[16]。研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)與miR-155的啟動子結(jié)合，下調(diào)miR-155的表達(dá)[17]。也有報道稱miR-155能夠通過STAT3信號通路調(diào)控Panc-1和Capan-2胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，以及Hep-2細(xì)胞在肝癌中的增殖和侵襲[18-19]。下調(diào)miR-155的表達(dá)能夠顯著降低胃癌細(xì)胞中VEGF、MMP2和MMP9的表達(dá)，以及增加SOCS1的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。miRNA-155通過與內(nèi)皮型-氧化氮合酶(eNOS) mRNA的3′ UTR結(jié)合抑制eNOS表達(dá)[21]，eNOS缺乏不僅會影響排卵，還會影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的成熟。eNOS敲除的小鼠會導(dǎo)致其卵巢缺陷，eNOS來源的一氧化氮(NO)是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟的調(diào)節(jié)劑[22]。牛發(fā)情周期的3，7 d，miR-155在次級卵泡和優(yōu)勢卵泡中均有差異表達(dá)，預(yù)示著在卵丘細(xì)胞中成熟的miR-155參與調(diào)控卵泡的發(fā)育[23]。

AdMax包裝系統(tǒng)是通過Cre/loxP獲得重組病毒，將攜帶目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒大部分基因組的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用進(jìn)行重組，獲取重組腺病毒。與典型同源重組法(雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染)、Ad-Easy法、Ad5/F35MaxTM包裝系統(tǒng)相比，AdMax包裝系統(tǒng)存在操作方便簡單、獲取的病毒滴度較高、重組效率較高且可高效表達(dá)目的基因等多種優(yōu)勢。本試驗(yàn)使用AdMax包裝系統(tǒng)成功獲得Ad-miR-155重組腺病毒，感染水牛卵丘細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)miR-155表達(dá)量顯著上調(diào)。過表達(dá)miR-155基因并檢測部分預(yù)測靶基因，發(fā)現(xiàn)Wee1、CD44、TRPS1顯著下調(diào)，Wee1蛋白激酶產(chǎn)物是成熟促進(jìn)因子(MPF)的負(fù)調(diào)節(jié)者[24]，Wee1包含Wee1A和Wee1B兩種亞型，它可以通過使Cdc2蛋白的Tyr-15位點(diǎn)發(fā)生磷酸化進(jìn)而抑制MPF的激活，而Cdc25可拮抗Wee1的作用以維持MPF活性，二者共同作用使MPF部分失活，這也是卵母細(xì)胞MⅠ/MⅡ轉(zhuǎn)化所必需的[25-26]。在哺乳動物體內(nèi)，體積小于正常細(xì)胞體積的80%的細(xì)胞不可以發(fā)生有絲分裂，細(xì)胞中MPF不能被激活，其主要原因是Wee1抑制了Cdc2的表達(dá)，導(dǎo)致Cdc2的量不足[27]。此外，Wee1蛋白激酶在DNA損傷檢查點(diǎn)作用過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在芽殖酵母中，需要RAD9基因產(chǎn)物來延遲有絲分裂的進(jìn)展，以應(yīng)對DNA損傷。比較DNA損傷造成的有絲分裂延遲和DNA合成抑制引起的延遲，發(fā)現(xiàn)DNA損傷造成的有絲分裂延遲需要Wee1蛋白激酶，而DNA合成抑制引起的有絲分裂延遲并不依賴Wee1蛋白激酶[28]。CD44是一種分布于細(xì)胞表面的糖蛋白分子，參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用。透明質(zhì)酸與其受體CD44結(jié)合會抑制細(xì)胞凋亡[29]，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)移[30]，刺激淋巴細(xì)胞[31]。有研究表明，CD44可能影響生育能力和卵母細(xì)胞的質(zhì)量[32]。此外在豬卵母細(xì)胞成熟過程中，卵丘細(xì)胞上CD44的表達(dá)與卵丘的擴(kuò)張存在相關(guān)性[33]。TRPS1是一種蛋白編碼基因，TRPS1基因的突變或缺失導(dǎo)致為鼻-指(趾)綜合征，該基因編碼一種具有9個鋅指結(jié)構(gòu)域的新型轉(zhuǎn)錄因子，其中包括1個單GATA型DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，TRPS1不僅在軟骨、關(guān)節(jié)和毛囊中表達(dá)，在小鼠胚胎發(fā)育過程中也在肺、腸、腎等其他組織中有表達(dá)，TRPS1基因被破壞的小鼠導(dǎo)致其軟骨發(fā)育不良，其特征是軟骨細(xì)胞增殖減少和生長板細(xì)胞凋亡減少[34]。敲除TRPS1小鼠研究發(fā)現(xiàn)TRPS1通過直接與STAT3基因啟動子區(qū)域的GATA位點(diǎn)結(jié)合，通過調(diào)節(jié)cyclin D1和Bcl-2的表達(dá)來調(diào)控軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡[35]。這些均表明miR-155在調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、凋亡等生物過程中起關(guān)鍵作用。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了可以感染水牛卵丘細(xì)胞的miRNA-155重組腺病毒載體，過表達(dá)miRNA-155基因后，顯著下調(diào)了Wee1、CD44、TRPS1基因表達(dá)量。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-155主要通過參與MAPK、PI3K-AKT和mTOR等信號通路。本試驗(yàn)為后續(xù)探究其在卵丘細(xì)胞中的功能提供了理論依據(jù)。