趙 雨, 孫典榮, 單斌斌, 劉 巖, 楊長平, 周文禮

基于微衛(wèi)星標(biāo)記的真鯛放流群體與增殖海域群體遺傳變異比較分析

趙 雨1, 2, 孫典榮2, 單斌斌2, 劉 巖2, 楊長平2, 周文禮1

(1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院, 天津 300384; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)院 南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510300)

真鯛()是中國沿岸海域重要的經(jīng)濟(jì)種類, 增殖放流作為修復(fù)真鯛漁業(yè)資源、恢復(fù)自然群體的方法, 現(xiàn)已在中國被廣泛地應(yīng)用。然而, 將大量人工繁育的苗種投入自然海域中, 可能會(huì)對自然群體造成一定程度的遺傳學(xué)影響。因此, 在開展真鯛增殖放流的同時(shí), 應(yīng)進(jìn)行遺傳監(jiān)測。本研究使用7對真鯛微衛(wèi)星標(biāo)記, 對2017年于防城港沿岸海域開展的真鯛增殖放流進(jìn)行遺傳監(jiān)測, 對比分析了真鯛親體、放流真鯛苗種以及放流后混合群體的遺傳多樣性。研究結(jié)果表明, 真鯛親本群體與真鯛放流群體的等位基因豐度(13.525 3, 16.428 6)和期望雜合度(0.792 7, 0.814 5)沒有明顯的差異, 表明在苗種繁育過程中, 沒有出現(xiàn)遺傳多樣性丟失的現(xiàn)象。真鯛放流群體和放流后混合群體的期望雜合度(0.814 5, 0.822 8)、等位基因豐度(16.428 6, 16.755 5)相似, 表明真鯛放流群體和放流后混合群體處于相同的遺傳多樣性水平。3個(gè)群體的多態(tài)信息含量為0.768 8~0.805 5, 表明3個(gè)群體均具有較高的遺傳多樣性。群體間遺傳分化指數(shù)(0.016 667)和遺傳距離(0.265 375~0.301 915)的結(jié)果顯示群體間的遺傳分化微弱, 未形成明顯的遺傳分化。因此, 可認(rèn)為本研究中真鯛增殖放流未對放流后混合群體造成明顯的遺傳學(xué)影響。本研究為今后真鯛增殖放流遺傳監(jiān)測提供了理論參考依據(jù)。

真鯛(); 微衛(wèi)星; 遺傳影響; 增殖放流

真鯛()隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鯛科(Sparidae), 俗稱紅加吉(Red Sea bream), 分布于印度洋和太平洋西部近海, 在中國由北至南近岸海域均有分布, 是中國名貴經(jīng)濟(jì)魚類和海水養(yǎng)殖的重要對象[1]。

20世紀(jì)50年代, 由于中國對真鯛資源的不合理開發(fā)與利用, 且缺乏對真鯛資源的有效保護(hù), 導(dǎo)致資源嚴(yán)重匱乏且短時(shí)間內(nèi)難以恢復(fù)[2]。為增加真鯛資源, 滿足市場需求, 中國在20世紀(jì)80年代末開始進(jìn)行真鯛的增殖放流活動(dòng)[3]。20世紀(jì)70年代~90年代真鯛苗種人工繁育與養(yǎng)殖的成功也為增殖放流提供了極大的便利[4]。1990年, 中國與日本合作, 在山東省5處放流地點(diǎn)共放流真鯛苗種73 024尾[5]。1991年~ 1995年間, 在渤海放流真鯛苗種90多萬尾[6]。此后放流量不斷增加, 改善了真鯛資源狀況[7-8]。近年來, 中國真鯛的增殖放流也在不斷進(jìn)行。東山縣在2018年6月和2019年6月分別放流真鯛苗種25.8621萬尾和23.2558萬尾[9-10]。石獅市于2018年在深滬灣梅林碼頭附近海域放流真鯛31萬尾[11]。嵊泗縣也于2019年6月進(jìn)行了真鯛的增殖放流[12]。

然而, 將大量人工繁育的苗種投入自然海域中, 可能會(huì)對自然群體造成一定程度的遺傳學(xué)影響[13-14]。放流群體不僅會(huì)與野生群體爭奪食物與生存空間[15], 還因其與野生群體存在的遺傳差異, 與自然群體產(chǎn)生的后代發(fā)生基因交流, 進(jìn)而影響其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[16]。有研究表明, 增殖放流會(huì)對自然群體造成遺傳學(xué)影響, Perez-Enriquez[17]等利用3個(gè)微衛(wèi)星對日本四國島周邊7個(gè)地點(diǎn)的真鯛群體開展研究, 以探究真鯛增殖放流對自然群體造成的遺傳學(xué)影響, 結(jié)果顯示放流后增殖海域內(nèi)的自然群體與鄰近海域的自然群體存在一定程度遺傳差異。Kitada[18]等通過遺傳監(jiān)測結(jié)合40 a時(shí)間的漁獲數(shù)據(jù), 評估了長期的增殖放流對日本鹿兒島灣的真鯛野生種群的大小和遺傳多樣性造成的影響, 其分析發(fā)現(xiàn), 增殖放流降低了該地真鯛種群的遺傳多樣性, 但隨著野生種群規(guī)模的增大, 遺傳效應(yīng)逐漸減弱, 并提出, 除非采取有效的措施控制捕撈量并恢復(fù)自然棲息地, 否則從長遠(yuǎn)來看, 為加強(qiáng)和保護(hù)種群而進(jìn)行的增殖放流的作用十分有限。Gonzalez[19]等通過研究廣島灣5個(gè)地點(diǎn)的黑鯛()發(fā)現(xiàn), 最高放流強(qiáng)度地點(diǎn)的黑鯛擁有最少的等位基因且與其中3個(gè)地點(diǎn)的群體遺傳分化顯著, 表明增殖放流對廣島灣黑鯛的遺傳多樣性造成了重要影響。Shan[20]等基于線粒體控制區(qū)的序列對珠江口的黑鯛增殖放流進(jìn)行了研究, 結(jié)果顯示放流后珠江口種群的遺傳多樣性低于其他野生種群, 黑鯛的放流可能影響了珠江口野生種群的遺傳多樣性。相反, Katalinas[21]等利用微衛(wèi)星對1999年~2011年間在南卡羅萊納進(jìn)行的美國紅魚()的增殖放流進(jìn)行了評估, 結(jié)果顯示放流并未對美國紅魚野生群體遺傳多樣性產(chǎn)生影響。Ozerov[22]等也利用微衛(wèi)星和SNPs評估了16 a間因增殖放流對芬蘭灣和波羅的海的大西洋鮭魚()野生種群的遺傳影響, 結(jié)果表明大西洋鮭魚的增殖放流增加了野生種群的等位基因豐富度, 但改變了其種群結(jié)構(gòu)。遺傳學(xué)分析可以幫助劃定魚類種群的邊界、了解種群的健康和大小, 并向管理人員提供放流的參考信息[23], 因此應(yīng)對野生群體進(jìn)行遺傳監(jiān)測, 以為漁業(yè)管理和增殖放流提供科學(xué)依據(jù)。

微衛(wèi)星以其廣泛分布、含量豐富, 多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn), 現(xiàn)已發(fā)展成為一種被廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)[24-26]。本研究利用微衛(wèi)星序列作為分子標(biāo)記, 對在防城港沿岸海域開展的真鯛增殖放流進(jìn)行遺傳監(jiān)測, 以期闡明其群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀, 為真鯛的資源保護(hù)及合理的開發(fā)提供基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

真鯛親體采自北海廣西海洋研究所養(yǎng)殖基地; 放流群體(子代群體)為真鯛親體繁育后所得后代; 2017年5月, 在防城港沿岸海域(108°05′E, 21°55′N)進(jìn)行增殖放流, 共放流體長為3.7~5.8 cm的真鯛苗種12.27萬尾; 放流后, 于2017年9月~2018年1月進(jìn)行采樣調(diào)查,回捕真鯛樣品(表1)。所有樣品經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)測量后, 取魚體背部肌肉組織于95%乙醇中保存, 以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 真鯛回捕信息

1.2 基因組DNA提取

取276尾真鯛親體、98尾放流真鯛以及294尾回捕真鯛樣品肌肉組織, 嚴(yán)格按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司, 北京)中的說明書操作步驟進(jìn)行DNA提取。

1.3 PCR擴(kuò)增及測序分型

選取多態(tài)性較高的7對微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增, 每對引物的5’端分別用TAM、FAM和HEX 3種熒光標(biāo)記, 具體引物信息見表2。PCR反應(yīng)總體積為25 μL, 其中包括10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTPs 2 μL, 雙向熒光引物各1 μL, Taq DNA聚合酶0.15 μL, 去離子水17.5 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性50 s, 在引物特定的退火溫度下退火50 s, 72℃延伸1 min, 循環(huán)35次; 最后72℃延伸10 min。制備1.5%瓊脂糖凝膠(含DuRed染料)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測, 篩選出擴(kuò)增成功的產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測, GeneMarker 2.2.0軟件收集各位點(diǎn)等位基因數(shù)據(jù), 然后進(jìn)行人工校正。

表2 對微衛(wèi)星引物的特征描述

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用PopGene[27]軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)()、觀測雜合度()、期望雜合度()、多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因()。使用FSTAT 2.9.3[28]軟件獲得其等位基因豐富度(S), 計(jì)算兩兩群體間遺傳分化指數(shù)ST并通過1000次隨機(jī)抽樣檢驗(yàn)顯著性。通過GENEPOP 4.0[29]檢驗(yàn)各位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。使用Micro-Checker[30]軟件檢測各位點(diǎn)是否存在無效等位基因。此外, 使用Population 1.2計(jì)算3個(gè)真鯛群體之間的遺傳距離[31]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 群體遺傳多樣性

本研究的3個(gè)真鯛群體在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上總等位基因數(shù)分別為115、115和151個(gè)等位基因(表3), 平均等位基因數(shù)為(16.429~21.571)。3個(gè)群體的有效等位基因數(shù)為(1.952~17.970), 均不同程度地低于其對應(yīng)的等位基因數(shù)。3個(gè)群體在7個(gè)位點(diǎn)的平均觀測雜合度為(0.778 4~0.793 0), 除真鯛親體群體外, 均低于其平均期望雜合度, 說明群體中發(fā)生了雜合子缺失。真鯛親本群體與真鯛放流群體的等位基因豐度(13.525 3, 16.428 6)和期望雜合度(0.792 7, 0.814 5)沒有明顯的差異, 表明在苗種繁育過程中, 沒有出現(xiàn)遺傳多樣性丟失的現(xiàn)象。真鯛放流群體和放流后混合群體的期望雜合度(0.814 5, 0.822 8)、等位基因豐度(16.428 6, 16.755 5)相似, 表明真鯛放流群體和放流后混合群體處于相同的遺傳多樣性水平。真鯛放流群體和真鯛親本群體分別在Pma4位點(diǎn)和Kpm7位點(diǎn)存在無效等位基因, 同時(shí)放流后混合群體在這兩個(gè)位點(diǎn)均存在無效等位基因。3個(gè)群體的多態(tài)信息含量為0.768 8~0.805 5, 表明3個(gè)群體均具有較高的遺傳多樣性。使用GENEPOP4.0對3個(gè)群體的7個(gè)位點(diǎn)逐個(gè)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的結(jié)果顯示, 真鯛親本群體與真鯛放流群體在7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg平衡, 而放流后混合群體中有4個(gè)位點(diǎn)顯著偏離平衡。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)

使用FSTAT 2.9.3計(jì)算的結(jié)果顯示, 放流后混合群體與真鯛親本群體、放流后混合群體與真鯛放流群體、真鯛親本群體與真鯛放流群體的遺傳分化指數(shù)ST為0.016 667, 表明兩兩群體間存在顯著地微弱的遺傳分化。計(jì)算真鯛群體間的遺傳距離, 結(jié)果顯示3個(gè)真鯛群體間遺傳距離較小(0.265 375~ 0.301 915)(表4)。

表3 真鯛群體遺傳多樣性參數(shù)

表4 真鯛群體間的FST值(對角線之下)和遺傳距離(對角線上)

*.<0.05

3 討論

遺傳多樣性關(guān)系到種群的進(jìn)化與適應(yīng), 物種對環(huán)境變化的適應(yīng)能力和進(jìn)化的潛力與種內(nèi)遺傳多樣性或變異性成正比, 并以此保持物種和整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的多樣性[32-33]。物種遺傳多樣性喪失的問題不僅在增殖放流活動(dòng)中至關(guān)重要, 更因其涉及生物體對環(huán)境變化的適應(yīng)性和進(jìn)化反應(yīng), 在保護(hù)遺傳學(xué)中受到高度重視[34]。Romo[35]等利用微衛(wèi)星標(biāo)記對條斑星鰈()在日本增殖放流的效果進(jìn)行了評估, 結(jié)果顯示放流群體與自然群體并無明顯遺傳差異, 該項(xiàng)目中增殖放流未產(chǎn)生消極影響。Kitada[36]等通過比較分析鹿兒島真鯛的放流和日本北部的太平洋鯡()的放流發(fā)現(xiàn), 雖然在真鯛群體和太平洋鯡群體中均出現(xiàn)稀有等位基因的丟失, 但放流群體對其產(chǎn)生的遺傳影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于由其生活史、環(huán)境和漁業(yè)選擇壓力造成的影響, 并提出增殖放流的遺傳影響的大小應(yīng)取決于種群的大小、放養(yǎng)強(qiáng)度、種群和放流后代的遺傳多樣性以及種群間的基因流動(dòng), 因此在增殖放流項(xiàng)目中保持種群的遺傳多樣性是非常重要的。Katalinas[21]等曾用微衛(wèi)星研究增殖放流對南卡羅來納河口美國紅魚()的遺傳影響, 其結(jié)果并未出現(xiàn)遺傳多樣性的顯著變化, 并推測可能是由于世代交疊、野生魚類種群規(guī)模大、美國紅魚表現(xiàn)出相對較長的壽命等對放流產(chǎn)生的遺傳影響起到一定的緩釋作用。本文中, 有52個(gè)親本個(gè)體在7個(gè)位點(diǎn)上共17個(gè)等位基因(Kpm25位點(diǎn)1個(gè)、Pma5位點(diǎn)2個(gè)、Pma4位點(diǎn)8個(gè)、Kpm28位點(diǎn)2個(gè)、Kpm11位點(diǎn)1個(gè)、Kpm23位點(diǎn)2個(gè),Kpm7位點(diǎn)1個(gè))未在子代中出現(xiàn), 因此這些親本個(gè)體并未實(shí)際參與繁殖。在子代中有24個(gè)個(gè)體在7個(gè)位點(diǎn)上共21個(gè)等位基因(Kpm25位點(diǎn)2個(gè)、Pma5位點(diǎn)2個(gè)、Pma4位點(diǎn)4個(gè)、Kpm28位點(diǎn)4個(gè)、Kpm11位點(diǎn)1個(gè)、Kpm23位點(diǎn)2個(gè), Kpm7位點(diǎn)6個(gè))未在親本中出現(xiàn), 推測是由于親本未采集完全。雖然本研究的親體樣品并未包含全部親體, 但由于樣品數(shù)量充足, 可以代表親體群體的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)。

等位基因豐富度、位點(diǎn)雜合度以及多態(tài)信息含量是反映群體遺傳多樣性的重要參數(shù)[37]。本研究與Gonzalez[34]等對相模灣和東京灣的真鯛群體進(jìn)行的研究采用了6對相同的微衛(wèi)星引物。在Kpm7(0.710~ 0.892, 0.565~0.721), Kpm23(0.822~0.845, 0.714~0.819), Kpm25(0.787~0.870, 0.755~0.844), Pma5(0.891~0.92, 0.857~0.877), Kpm11(0.469~0.712, 0.476~0.616)這5個(gè)位點(diǎn)上, 本研究中真鯛群體的觀測雜合度略低于日本學(xué)者的研究群體, 僅在Kpm28位點(diǎn)上略高于日本群體(0.87~0.947, 0.946~0.980)。本研究中的3個(gè)群體在各個(gè)位點(diǎn)上的平均觀測雜合度(0.778~0.793)、平均期望雜合度(0.793~0.823)和平均等位基因豐富度(13.525~16.756)略低于Sawayama[38]等在日本瀨戶內(nèi)海采集的野生群體(0.952, 0.939, 17.4)和Sawayama[39]等在日本愛媛縣附近采集的研究群體(0.719~0.906, 0.714~0.938, 7.0~25.3), 但總體上無明顯差異, 證明本研究中的真鯛群體與日本群體處于相同的遺傳多樣性水平。通常, 用于繁育增殖放流苗種的親體數(shù)量有限, 人工繁育苗種的遺傳多樣性較野生群體低, 被投入自然海域的放流苗種通過與野生群體之間的基因交流從而降低野生群體的遺傳多樣性, 因此放流苗種應(yīng)盡可能減小與野生群體之間的差異[34]。Gonzalez[40]等曾用6個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記比較了廣島灣放流黑鯛與野生黑鯛的遺傳多樣性, 結(jié)果表明雖然群體間觀察到較微弱的遺傳多樣性差異, 但這種對廣島灣野生種群遺傳組成潛在的有害影響, 使得有必要對增殖放流的遺傳效應(yīng)進(jìn)行定期監(jiān)測。在季曉芬[41]利用13對微衛(wèi)星評估草魚增殖放流對野生群體遺傳多樣性影響的研究中, 雖然在石首、監(jiān)利兩地的放流群體為人工養(yǎng)殖群體, 但草魚放流群體仍保持較高的遺傳多樣性, 推測是由于其苗種來源于長江。胡新艷[42]等也利用微衛(wèi)星對用于放流的養(yǎng)殖群體遺傳多樣性進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示可能是由于親代的人工選擇的干擾, 導(dǎo)致了雜合子的缺失和過剩。在本研究中, 真鯛親本群體與真鯛放流群體的等位基因豐度(13.5253, 16.4286)和期望雜合度(0.7927, 0.8145)沒有明顯的差異, 推測可能本實(shí)驗(yàn)在苗種繁育過程中使用了足夠數(shù)量的親本, 使得放流苗種中未發(fā)生明顯的遺傳多樣性丟失。

群體遺傳分化指數(shù)ST是利用遺傳信息反映群體之間遺傳分化的指標(biāo), 數(shù)值越大表明兩群體間的遺傳分化水平越高[40]。Wright[43]提出遺傳分化指數(shù)度量標(biāo)準(zhǔn): 0

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Comparison and analysis of genetic variation between the released population and the population in the breeding area ofbased on microsatellite markers

ZHAO Yu1, 2, SUN Dian-rong2, SHAN Bin-bin2, LIU Yan2, YANG Chang-ping2, ZHOU Wen-li1

(1.College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Key Lab of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture; South China Sea Fisheries Research Institute, China Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China)

is an important economic species in China’os coastal waters andstock enhancement is atool commonly used to restore the fish stocks. Putting large numbers of hatchery-raised fish into natural habitats can however have some genetic effect on the natural population. Therefore, genetic monitoring should be carried concurrently. In this study, after the release of the stock enhancement in Fangchenggang in 2017, 7 polymorphism microsatellite markers were selected to genotype the genetic differentiation among brood-stock, offspring, and the mixed population. The findings showed that there was no significant difference in allelic richness (13.525 3, 16.428 6) and expected heterozygosity (0.792 7, 0.814 5) between the broodstock and offspring populations, suggesting that there was no loss of genetic diversity in the breeding process.Additionally, the expected heterozygosity (0.814 5, 0.822 8) and allelic richness (16.428 6, 16.755 5) of the offspring and the mixed population after release were similar, suggesting that the two populations had the same genetic diversity.The three populations had a polymorphic information content of 0.7688-0.8055, indicating high genetic variation among the three populations. Moreover, the results of the index of genetic differentiation (0.016 667) and the genetic distance (0.265 375-0.301 915) showed that the genetic differentiation between populations was low and no significant genetic differentiation was established. In summary, after publication, there was hardly any genetic effect of stock enhancement on the mixed population.

; genetic effect; microsatellite markers; stock enhancement

Nov. 18, 2019

S931.5

A

1000-3096(2020)010-0066-08

10.11759/hykx20191118005

2019-11-18;

2020-03-09

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2020TD01); 中國-東盟海上合作基金資助項(xiàng)目(2016100020); 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2019B121201001)

[Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, No. 2020TD01; China-ASEAN Maritime Cooperation Fund, No. 2016100020; Science and Technology Project of Guangdong Province, No. 2019B121201001]

趙雨(1996-), 女, 碩士研究生, 主要從事漁業(yè)資源保護(hù)與環(huán)境修復(fù)研究, E-mail: nzhaoyu@yeah.net; 周文禮,通信作者, 研究員, E-mail: saz0908@126.com

(本文編輯: 譚雪靜)