王歡歡，宋丹丹，葛瑩，張雷，樓立峰，章學(xué)東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

蛋殼是雞蛋的重要組成部分，起著支撐、保護(hù)蛋內(nèi)容物和胚胎的作用，同時(shí)也是殼內(nèi)物質(zhì)與外界環(huán)境的溝通渠道。雞蛋的運(yùn)輸、貯存和孵化等過(guò)程與蛋殼質(zhì)量密切相關(guān)，蛋殼質(zhì)量是衡量雞蛋品質(zhì)的重要指標(biāo)。蛋殼質(zhì)量主要包括蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋形指數(shù)、表面暗斑、蛋殼微觀結(jié)構(gòu)等。蛋殼由高度有序的多層膜和鈣化基質(zhì)構(gòu)成，可分為殼膜、乳突層、柵欄層、晶體層和表層等[1-2]。在蛋殼形成過(guò)程中，表層沉積了由蛋殼腺上皮細(xì)胞分泌的原卟啉、膽綠素及其鋅螯合物等不同色素物質(zhì)，從而呈現(xiàn)出褐、粉、白、藍(lán)、綠等多種蛋殼顏色。已有研究發(fā)現(xiàn)，蛋殼顏色與種蛋的孵化率有一定的相關(guān)性[3-4]。實(shí)際生產(chǎn)中，綠殼雞蛋的出雛率相對(duì)較低。本試驗(yàn)對(duì)孵化后期的綠殼雞蛋進(jìn)行噴醋處理，并分析孵化前后蛋殼超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)合雛雞出殼的情況，以期為提高綠殼雞蛋孵化效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 處理設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用綠殼雞蛋產(chǎn)自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院自行培育的BG系烏骨雞。隨機(jī)選擇種蛋210枚(選取其中5枚作為A組，不進(jìn)行孵化)，進(jìn)入全自動(dòng)孵化箱孵化，第10天通過(guò)照蛋確定受精種蛋。第18天時(shí)，將192枚受精蛋平均分為2組(B組和C組)，B組按常規(guī)轉(zhuǎn)入出雛箱，繼續(xù)孵化至雛雞出殼；C組轉(zhuǎn)出雛箱后，每天用5%醋酸噴濕種蛋表面1次，直至雛雞出殼。

1.2 電子顯微鏡觀察

選擇進(jìn)箱孵化前種蛋的蛋殼(A)、常規(guī)孵化出雛后的蛋殼(B)、噴醋處理出雛后的蛋殼(C)各5個(gè)，剝除蛋殼內(nèi)膜。在每個(gè)蛋殼樣本的清潔、干燥、平整度好的一致區(qū)域，選取小片蛋殼，粘貼到進(jìn)樣臺(tái)上，噴金，然后置入HITACHI SU-70型掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)常規(guī)孵化組(B)和噴醋處理組(C)的受精種蛋數(shù)和出殼雛雞數(shù)，計(jì)算受精蛋出雛率，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。運(yùn)用Image Pro Plus軟件測(cè)算各個(gè)鏡檢樣本的蛋殼厚度、乳突層和有效層厚度、氣孔數(shù)、氣孔面積等，并用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異顯著性以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋殼內(nèi)表面

如圖1所示，孵化前的蛋殼雖已剝除肉眼可見的殼膜，但仍可見大量縱橫分叉、粗細(xì)不等的蛋白質(zhì)纖維，層疊交織形成比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，蛋白纖維表面有很多顆粒狀的突起和結(jié)節(jié)，可能起到加固、聯(lián)結(jié)作用。蛋殼孵化出雛后，內(nèi)表面蛋白纖維消失，乳突椎體暴露，椎體前部已經(jīng)崩解呈蜂窩狀。

圖1 各組別蛋殼內(nèi)表面的電鏡觀察(400×)

2.2 蛋殼橫斷面分層結(jié)構(gòu)

蛋殼由內(nèi)到外可分為殼膜、乳突層、柵欄層、晶體層和表層。

孵化前蛋殼分層結(jié)構(gòu)比較清晰、各層排列緊密，內(nèi)層殼膜明顯；孵化后蛋殼結(jié)構(gòu)疏松，層級(jí)模糊，殼膜消失(圖2)。

圖2 各組別蛋殼橫斷面的電鏡觀察(200×)

蛋殼厚度測(cè)量結(jié)果見表1。常規(guī)孵化后和噴醋處理孵化后的平均蛋殼厚度分別為276.3、275.4 μm，均顯著低于孵化前的平均蛋殼厚度(P<0.05)。其中，孵化后蛋殼的乳突層厚度均顯著低于孵化前蛋殼(P<0.05)，而有效層厚度差異不顯著，表明孵化前后蛋殼厚度的變化主要源于乳突層厚度的變化。

表1 各組別的蛋殼厚度

2.2.1 乳突層

蛋殼乳突層緊貼殼膜，其基本結(jié)構(gòu)是錐核和乳突單元。孵化前蛋殼的乳突單元排列整齊、緊致，錐核明顯；孵化后蛋殼的乳突單元松散，錐核崩解，圓錐形頂部幾乎消失，乳突層厚度下降(圖3)。

2.2.2 柵欄層

柵欄層緊貼乳突單元，是蛋殼的主體結(jié)構(gòu)部分。柵欄層由致密堆疊的塊柱狀單元組成，密布大小、形狀和深淺不一的孔洞，可以有效化解應(yīng)力、提高強(qiáng)度；孵化前后，3組蛋殼的柵欄層厚度、質(zhì)地似無(wú)明顯差別(圖4)。如表2所示，孵化前后，蛋殼柵欄層的孔洞數(shù)無(wú)顯著差異。

表2 各組別柵欄層孔洞的分布情況

圖3 各組別蛋殼乳突層的電鏡觀察(1 500×)

圖4 各組別蛋殼柵欄層的電鏡觀察(6 000×)

2.2.3 晶體層和表層

晶體層緊接?xùn)艡趯?，具有一些小的孔洞。從圖5可見，孵化前蛋殼晶體層中的內(nèi)層方解石結(jié)構(gòu)呈傘狀緊密排列，外層顆粒致密；孵化后蛋殼的晶體層無(wú)傘狀排列，顆粒比較松散，噴醋處理組蛋殼晶體外層更加疏松。孵化前，蛋殼表面角質(zhì)層清晰可辨，表層可見裂隙；孵化后，蛋殼角質(zhì)層消失。

圖5 各組別蛋殼晶體層的電鏡觀察(6 000×)

2.3 蛋殼外表面

孵化前蛋殼外表面比較光滑，龜背狀裂紋多而細(xì)長(zhǎng)，邊緣清晰，裂隙窄而深；常規(guī)孵化后，蛋殼外表面比較粗糙，裂紋相對(duì)較少，裂隙寬而淺；噴醋處理后，表面裂紋更少，蛋殼外表面有顆粒物堆積(圖6)。

2.4 孵化出雛結(jié)果

常規(guī)孵化和噴醋處理后孵化，受精蛋出雛率分別為81.3%、86.5%，組間差異不顯著。

3 討論

3.1 孵化前后蛋殼超微結(jié)構(gòu)變化

乳突層是蛋殼形成過(guò)程中殼膜蛋白纖維開始鈣化的部位，乳突單元與殼膜的聯(lián)系、乳突之間排列是否規(guī)則整齊將直接影響蛋殼其他各層的形成，從而決定蛋殼質(zhì)量[5]。在雞胚發(fā)育過(guò)程中，初期鈣源主要來(lái)自蛋黃；雞胚發(fā)育中后期，乳突錐核中的鈣微晶顆粒成為胚胎發(fā)育的主要鈣源[6]。本研究中，孵化后蛋殼的乳突層結(jié)構(gòu)變化顯著，殼膜消失，乳突外露，乳突表面呈蜂窩狀凹陷，厚度顯著低于孵化前。乳突結(jié)構(gòu)的破壞從內(nèi)部降低了蛋殼的強(qiáng)度，有利于雛雞從內(nèi)部啄破蛋殼。

本研究中，孵化前后蛋殼的柵欄層和晶體層厚度變化較小。碳酸鈣是蛋殼的主要成分，常以方解石、霰石、球霰石等3種形式存在于自然界中，方解石最穩(wěn)定[7]。孵化前晶體層碳酸鈣以方解石形態(tài)存在，排列細(xì)密有序；孵化后的蛋殼結(jié)構(gòu)疏松失序，可能與部分鈣質(zhì)流失有關(guān)[8]，蛋殼結(jié)構(gòu)致密性降低，同樣使蛋殼強(qiáng)度下降，利于雛雞出殼。

A～C分別為孵化前、常規(guī)孵化、噴醋處理后蛋殼(200×)；D～F分別為孵化前、常規(guī)孵化、噴醋處理后蛋殼(6 000×)。圖6 蛋殼外表面的電鏡觀察

蛋殼表面角質(zhì)層主要由糖蛋白類、多糖、脂類、色素、無(wú)機(jī)磷酸鹽等組成[9]，能隔絕外界環(huán)境，防止蛋內(nèi)水分蒸發(fā)，同時(shí)抑制蛋殼表面微生物滋生。在孵化后期，蛋殼角質(zhì)層逐漸消失，外表面裂隙增大，有利于氣體交換。

3.2 噴醋處理對(duì)蛋殼結(jié)構(gòu)的影響

膽綠素是一種強(qiáng)抗氧化劑，產(chǎn)綠殼蛋的母雞通過(guò)在蛋殼中沉積膽綠素去除了循環(huán)中的抗氧化劑，從而具有更高的控制自由基的能力。Zikic等[10]對(duì)不同蛋殼顏色野雞的肌纖維進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)綠殼或藍(lán)殼蛋孵出的雛雞的胸肌細(xì)胞直徑較小，肌肉力量弱于褐殼蛋雛雞。Kozuszek等[11]研究表明，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，種蛋的囊胚細(xì)胞數(shù)不斷減少，綠殼蛋的減少數(shù)顯著高于褐殼蛋。這些情況均可能是導(dǎo)致綠殼種蛋孵化出雛率低于褐殼蛋的原因。醋酸與蛋殼的碳酸鈣成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后，會(huì)形成結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松的醋酸鈣，這是噴醋處理降低蛋殼強(qiáng)度、提高出雛率的出發(fā)點(diǎn)。本次研究結(jié)果表明，醋酸噴灑后蛋殼外表面有明顯變化，反應(yīng)產(chǎn)物堆積在蛋殼表面，雖然蛋殼厚度等與常規(guī)孵化差異不顯著，但孵化率有所提高。已有研究指出，用弱酸處理蛋殼表層可增加蛋殼的導(dǎo)電率，增強(qiáng)水蒸氣和CO2在殼體的移動(dòng)，并改變蛋白的pH值，從而影響雞蛋的孵化率[12]。Shafey等[13]在孵化前將29周齡母雞所產(chǎn)種蛋浸泡在酸性維生素C溶液2 min，結(jié)果顯示維生素C處理提高了種蛋導(dǎo)電率，并顯著提高了種蛋的孵化率。因此，噴醋處理對(duì)于提高綠殼雞蛋的孵化出雛率應(yīng)該起到了實(shí)際效用。本次試驗(yàn)各處理差異并不顯著，可能與醋酸濃度、處理次數(shù)、持續(xù)時(shí)間、種蛋數(shù)量等有關(guān)，還需通過(guò)深化研究進(jìn)行驗(yàn)證。