張海燕 牛輝 畢利利

華蘭基因工程有限公司 河南新鄉(xiāng) 453000

1 概述

1.1 單克隆抗體介紹

從1975 年 至 今， 單 克 隆 抗 體（monoclon alanti body，mAb）經(jīng)歷了從簡單的雜交瘤細(xì)胞株中表達(dá)到使用成熟的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的歷程。目前，單克隆抗體可以分為三類，分別是鼠源性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體，其中全人源單克隆抗體也可算作人源化單克隆抗體的一個(gè)分類。

1.2 中國倉鼠卵巢細(xì)胞

CHO 細(xì)胞是指中國倉鼠卵巢細(xì)胞，是從中國灰倉鼠卵巢組織經(jīng)過分離，然后進(jìn)行連續(xù)傳代而得到的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。目前CHO細(xì)胞是應(yīng)用最為廣泛的抗體生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前有超過70%的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品由CHO 細(xì)胞表達(dá)和生產(chǎn)，在我國現(xiàn)有的絕大多數(shù)生物大分子藥物都是由CHO 細(xì)胞表達(dá)[1]。

2 大規(guī)模培養(yǎng)工藝及可能存在的問題

規(guī)模放大策略。細(xì)胞培養(yǎng)工藝過程中的參數(shù)可以分為兩類：與體積相關(guān)的參數(shù)和與體積無關(guān)的參數(shù)。隨著反應(yīng)器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù)，在放大過程中會(huì)根據(jù)反應(yīng)器通氣孔徑的大小和方式，以及攪拌槳的大小和形式而發(fā)生變化。一般來說，隨著反應(yīng)器體積的變大，通氣速率一般呈線性上升的趨勢。通氣流速的放大一般采用單位體積單位時(shí)間的通氣量（vvm）恒定的方法。其中，O2和CO2流速的放大方法在實(shí)際的操作過程中還要根據(jù)反應(yīng)器中DO 和pH 控制器的類型以及工藝要求的控制策略做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在參數(shù)放大過程中，反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速的放大需要考慮的因素比較多。大型反應(yīng)器的攪拌速度需要考慮既能夠?yàn)榉磻?yīng)器提供足夠的混合能力，還要避免造成由于高轉(zhuǎn)速條件下剪切力所引起的不必要的細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)速對體積氧傳遞系數(shù)（KLa）的影響，也是在放大過程中需要考慮的一個(gè)重要因素[2]。

3 CHO 細(xì)胞培養(yǎng)方法

隨著重組蛋白等生物大分子藥物的開發(fā)和發(fā)展，CHO 細(xì)胞的培養(yǎng)工藝研究也不斷地深入。根據(jù)培養(yǎng)的方式CHO 細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝可以分為批次培養(yǎng)（Batch）、補(bǔ)料批次培養(yǎng)（Fed-Batch）、連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)又包括濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)（ConcentratedFedbatch）和灌流（注）培養(yǎng)（Perfusion）等。在細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)中，需要根據(jù)各個(gè)項(xiàng)目的不同特點(diǎn)，如宿主細(xì)胞的性質(zhì)、宿主細(xì)胞在培養(yǎng)環(huán)境中能夠維持的培養(yǎng)周、細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的穩(wěn)定性等方面綜合評估后選擇合適的培養(yǎng)方式。

3.1 批培養(yǎng)方式的應(yīng)用

批培養(yǎng)方式相比其他培養(yǎng)方式，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過程中不需要進(jìn)行補(bǔ)加營養(yǎng)物的操作，所以在生產(chǎn)過程中需要的操作少，減少了培養(yǎng)過程中微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面由于不進(jìn)行補(bǔ)料操作，培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物的含量在培養(yǎng)開始時(shí)已經(jīng)確定，隨著細(xì)胞的生長營養(yǎng)物不斷減少，代謝產(chǎn)物持續(xù)升高，所以生產(chǎn)周期相對較短，對于宿主細(xì)胞本身不能維持長期生長、細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品在培養(yǎng)液中容易產(chǎn)生降解、聚集等質(zhì)量變化的項(xiàng)目更為適合。

3.2 補(bǔ)料批培養(yǎng)方式的應(yīng)用

由于批培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物持續(xù)下降，代謝產(chǎn)物持續(xù)增加，限制了細(xì)胞培養(yǎng)的周期，進(jìn)一步限制了目的蛋白的表達(dá)量。隨著細(xì)胞生長而逐漸降低的營養(yǎng)物，為細(xì)胞的生長提供所需營養(yǎng)。所以相比于不補(bǔ)料的批培養(yǎng)方式，補(bǔ)料批培養(yǎng)一般能得到更高的細(xì)胞密度，更長的細(xì)胞培養(yǎng)周期，更高的蛋白表達(dá)量。補(bǔ)料批培養(yǎng)方式也是目前應(yīng)用最多，技術(shù)發(fā)展最完善的培養(yǎng)方式。雖然補(bǔ)料批培養(yǎng)方式能向培養(yǎng)體系中補(bǔ)充已經(jīng)消耗的營養(yǎng)物，為細(xì)胞生長持續(xù)提供營養(yǎng)，但隨著細(xì)胞密度的增加，細(xì)胞消耗越來越多的營養(yǎng)同時(shí)代謝出越來越多的代謝廢物，而這些代謝廢物無法從培養(yǎng)環(huán)境中被分離，最終仍然會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活率的下降，細(xì)胞培養(yǎng)周期一般也較為固定，目前多數(shù)的補(bǔ)料批培養(yǎng)工藝的周期約12-18 天。

3.3 連續(xù)培養(yǎng)

由于補(bǔ)料批培養(yǎng)方式只能向培養(yǎng)體系中補(bǔ)充營養(yǎng)物，無法將細(xì)胞代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物從培養(yǎng)環(huán)境中去除，所以細(xì)胞在培養(yǎng)到一定時(shí)間后仍然會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞活率下降的現(xiàn)象。所以在細(xì)胞培養(yǎng)工藝的不斷幾步中，發(fā)展出了濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)兩種培養(yǎng)模式，這兩種新的培養(yǎng)模式都能很好的解決了培養(yǎng)環(huán)境中細(xì)胞代謝廢物對細(xì)胞的副作用。

濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)法由于不能將目的蛋白從培養(yǎng)液中分離，所以在培養(yǎng)過程中，目的蛋白的濃度在不斷升高，對于那些在培養(yǎng)液中不穩(wěn)定的目的蛋白并不適用。而灌注培養(yǎng)法在培養(yǎng)的過程中不斷地將目的蛋白從培養(yǎng)液中分離，而只把細(xì)胞截留在培養(yǎng)液中，所以目的蛋白在從細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)到胞外后，即可在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)入到純化環(huán)節(jié)，可以將目的蛋白與宿主細(xì)胞自身表達(dá)的酶分離。

4 培養(yǎng)基

本研究采用的培養(yǎng)基均為目前應(yīng)用廣泛的商業(yè)化培養(yǎng)基，配方如表1。

表1 培養(yǎng)基配方

5 結(jié)語

隨著醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)越來越受到人們的關(guān)注，作為生物醫(yī)學(xué)的重要組成部分，單克隆抗體在CHO 細(xì)胞中的大規(guī)模培養(yǎng)和表達(dá)技術(shù)越來越多。通過對其CHO 細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)參數(shù)分析及工藝的放大等研究分析來實(shí)現(xiàn)CHO 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)而推動(dòng)單克隆抗體產(chǎn)業(yè)在醫(yī)藥領(lǐng)域的不斷向前發(fā)展。