張海燕 牛輝 畢利利

華蘭基因工程有限公司 河南新鄉(xiāng) 453000

1 概述

1.1 單克隆抗體介紹

從1975 年 至 今， 單 克 隆 抗 體（monoclon alanti body，mAb）經(jīng)歷了從簡單的雜交瘤細胞株中表達到使用成熟的動物細胞進行大規(guī)模生產(chǎn)的歷程。目前，單克隆抗體可以分為三類，分別是鼠源性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體，其中全人源單克隆抗體也可算作人源化單克隆抗體的一個分類。

1.2 中國倉鼠卵巢細胞

CHO 細胞是指中國倉鼠卵巢細胞，是從中國灰倉鼠卵巢組織經(jīng)過分離，然后進行連續(xù)傳代而得到的哺乳動物細胞。目前CHO細胞是應(yīng)用最為廣泛的抗體生產(chǎn)動物細胞，據(jù)統(tǒng)計目前有超過70%的動物細胞表達產(chǎn)品由CHO 細胞表達和生產(chǎn)，在我國現(xiàn)有的絕大多數(shù)生物大分子藥物都是由CHO 細胞表達[1]。

2 大規(guī)模培養(yǎng)工藝及可能存在的問題

規(guī)模放大策略。細胞培養(yǎng)工藝過程中的參數(shù)可以分為兩類：與體積相關(guān)的參數(shù)和與體積無關(guān)的參數(shù)。隨著反應(yīng)器規(guī)模大小變化而變化的參數(shù)，在放大過程中會根據(jù)反應(yīng)器通氣孔徑的大小和方式，以及攪拌槳的大小和形式而發(fā)生變化。一般來說，隨著反應(yīng)器體積的變大，通氣速率一般呈線性上升的趨勢。通氣流速的放大一般采用單位體積單位時間的通氣量（vvm）恒定的方法。其中，O2和CO2流速的放大方法在實際的操作過程中還要根據(jù)反應(yīng)器中DO 和pH 控制器的類型以及工藝要求的控制策略做適當?shù)恼{(diào)整。在參數(shù)放大過程中，反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速的放大需要考慮的因素比較多。大型反應(yīng)器的攪拌速度需要考慮既能夠為反應(yīng)器提供足夠的混合能力，還要避免造成由于高轉(zhuǎn)速條件下剪切力所引起的不必要的細胞損傷。轉(zhuǎn)速對體積氧傳遞系數(shù)（KLa）的影響，也是在放大過程中需要考慮的一個重要因素[2]。

3 CHO 細胞培養(yǎng)方法

隨著重組蛋白等生物大分子藥物的開發(fā)和發(fā)展，CHO 細胞的培養(yǎng)工藝研究也不斷地深入。根據(jù)培養(yǎng)的方式CHO 細胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝可以分為批次培養(yǎng)（Batch）、補料批次培養(yǎng)（Fed-Batch）、連續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)又包括濃縮補料培養(yǎng)（ConcentratedFedbatch）和灌流（注）培養(yǎng)（Perfusion）等。在細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)中，需要根據(jù)各個項目的不同特點，如宿主細胞的性質(zhì)、宿主細胞在培養(yǎng)環(huán)境中能夠維持的培養(yǎng)周、細胞表達產(chǎn)品的穩(wěn)定性等方面綜合評估后選擇合適的培養(yǎng)方式。

3.1 批培養(yǎng)方式的應(yīng)用

批培養(yǎng)方式相比其他培養(yǎng)方式，因為在培養(yǎng)過程中不需要進行補加營養(yǎng)物的操作，所以在生產(chǎn)過程中需要的操作少，減少了培養(yǎng)過程中微生物污染的風(fēng)險。另一方面由于不進行補料操作，培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物的含量在培養(yǎng)開始時已經(jīng)確定，隨著細胞的生長營養(yǎng)物不斷減少，代謝產(chǎn)物持續(xù)升高，所以生產(chǎn)周期相對較短，對于宿主細胞本身不能維持長期生長、細胞表達產(chǎn)品在培養(yǎng)液中容易產(chǎn)生降解、聚集等質(zhì)量變化的項目更為適合。

3.2 補料批培養(yǎng)方式的應(yīng)用

由于批培養(yǎng)過程中隨著細胞生長，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物持續(xù)下降，代謝產(chǎn)物持續(xù)增加，限制了細胞培養(yǎng)的周期，進一步限制了目的蛋白的表達量。隨著細胞生長而逐漸降低的營養(yǎng)物，為細胞的生長提供所需營養(yǎng)。所以相比于不補料的批培養(yǎng)方式，補料批培養(yǎng)一般能得到更高的細胞密度，更長的細胞培養(yǎng)周期，更高的蛋白表達量。補料批培養(yǎng)方式也是目前應(yīng)用最多，技術(shù)發(fā)展最完善的培養(yǎng)方式。雖然補料批培養(yǎng)方式能向培養(yǎng)體系中補充已經(jīng)消耗的營養(yǎng)物，為細胞生長持續(xù)提供營養(yǎng)，但隨著細胞密度的增加，細胞消耗越來越多的營養(yǎng)同時代謝出越來越多的代謝廢物，而這些代謝廢物無法從培養(yǎng)環(huán)境中被分離，最終仍然會導(dǎo)致細胞活率的下降，細胞培養(yǎng)周期一般也較為固定，目前多數(shù)的補料批培養(yǎng)工藝的周期約12-18 天。

3.3 連續(xù)培養(yǎng)

由于補料批培養(yǎng)方式只能向培養(yǎng)體系中補充營養(yǎng)物，無法將細胞代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物從培養(yǎng)環(huán)境中去除，所以細胞在培養(yǎng)到一定時間后仍然會出現(xiàn)細胞活率下降的現(xiàn)象。所以在細胞培養(yǎng)工藝的不斷幾步中，發(fā)展出了濃縮補料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)兩種培養(yǎng)模式，這兩種新的培養(yǎng)模式都能很好的解決了培養(yǎng)環(huán)境中細胞代謝廢物對細胞的副作用。

濃縮補料培養(yǎng)法由于不能將目的蛋白從培養(yǎng)液中分離，所以在培養(yǎng)過程中，目的蛋白的濃度在不斷升高，對于那些在培養(yǎng)液中不穩(wěn)定的目的蛋白并不適用。而灌注培養(yǎng)法在培養(yǎng)的過程中不斷地將目的蛋白從培養(yǎng)液中分離，而只把細胞截留在培養(yǎng)液中，所以目的蛋白在從細胞內(nèi)被表達到胞外后，即可在較短的時間內(nèi)進入到純化環(huán)節(jié)，可以將目的蛋白與宿主細胞自身表達的酶分離。

4 培養(yǎng)基

本研究采用的培養(yǎng)基均為目前應(yīng)用廣泛的商業(yè)化培養(yǎng)基，配方如表1。

表1 培養(yǎng)基配方

5 結(jié)語

隨著醫(yī)藥行業(yè)的不斷發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)越來越受到人們的關(guān)注，作為生物醫(yī)學(xué)的重要組成部分，單克隆抗體在CHO 細胞中的大規(guī)模培養(yǎng)和表達技術(shù)越來越多。通過對其CHO 細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)參數(shù)分析及工藝的放大等研究分析來實現(xiàn)CHO 細胞大規(guī)模培養(yǎng)表達單克隆抗體生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性，進而推動單克隆抗體產(chǎn)業(yè)在醫(yī)藥領(lǐng)域的不斷向前發(fā)展。