鄧 燕， 劉 慧， 張飛旭， 吳 俠， 鄭 靜， 張井巖

（華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一種能量依賴性藥物外排泵，通過腺苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）水解供能發(fā)揮轉(zhuǎn)運作用[1]。為了防止機體對有害物質(zhì)的吸收，P-gp 可以介導(dǎo)細(xì)胞外源性物質(zhì)的排出，從而保護(hù)一些重要組織和器官，這是機體在生理狀態(tài)下的自身防御保護(hù)機制之一[2]。但是在P-gp 過表達(dá)的癌細(xì)胞中，P-gp 的轉(zhuǎn)運外排作用也會將抗腫瘤藥物逆濃度梯度泵出細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷降低，這是癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性（Multidrug Resistance，MDR）的關(guān)鍵因素之一[3-4]。在過去20 多年里，P-gp 抑制劑的開發(fā)作為逆轉(zhuǎn)P-gp 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞MDR 的一個重要的方向，一直受到廣泛關(guān)注[5]。到目前為止，P-gp 抑制劑的開發(fā)已歷經(jīng)3 代，但臨床上使用的P-gp 抑制劑的特異性不高，副作用較大，使治療功效受到明顯限制[6]。雖然許多天然產(chǎn)物，如黃酮類化合物、萜類化合物等都表現(xiàn)出對P-gp 的活性抑制作用[7?8]，但往往抑制劑活性較低。

自順鉑抗癌活性被發(fā)現(xiàn)以來，金屬配合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[9]。金屬離子的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)多樣性可以不斷豐富候選藥物庫，給藥物設(shè)計領(lǐng)域提供了眾多可能性[10-12]。近年來，研究者對酶結(jié)構(gòu)和功能等知識的豐富積累以及許多金屬離子對多種酶活性的特異性抑制活性[13-16]，均極大地推動了具有酶抑制活性的新型金屬藥物的發(fā)展。目前，已開發(fā)出針對蛋白質(zhì)脂質(zhì)激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、端粒酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等具有活性抑制的金屬配合物[17]。

相比于合成的小分子抑制劑，天然產(chǎn)物抑制劑雖然活性低，但是有它們自身的優(yōu)勢。為了提高天然產(chǎn)物抑制劑的活性，本文以具有低抑制活性的黃酮類化合物槲皮苷為配體，通過金屬離子與槲皮苷配位，合成槲皮苷銅配合物（Cu-Quercitrin）和槲皮苷鋅配合物（Zn-Quercitrin）。結(jié)果表明槲皮苷銅配合物表現(xiàn)出較好的抑制P-gp 活性的能力，表明槲皮苷金屬配合物在抑制P-gp 轉(zhuǎn)運、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞MDR 方面具有潛在應(yīng)用價值。

1 實驗部分

1.1 材料與方法

1.1.1 材料與試劑 槲皮苷（純度98%）、一水合醋酸銅（純度99%）、醋酸鋅（純度99%）、無水甲醇（純度99%），均購于阿拉丁試劑有限公司；羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123）、阿霉素（Doxorubicin，DOX）、維拉帕米，均購于西格瑪奧德里奇上海有限公司；RPMI 1640 完全培養(yǎng)基購于賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購于美國Gibco 公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、細(xì)胞腺苷三磷酸（ATP）檢測試劑盒均購于上海碧云天生物科技有限公司；P-gp 單克隆抗體和二抗購于艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADR 和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 購于中科院上海細(xì)胞庫。RPMI 1640 完全培養(yǎng)基用于MCF-7 和MCF-7/ADR 的培養(yǎng)，RPMI 1640 培養(yǎng)基中額外補充體積分?jǐn)?shù)10% 的加強新生牛血清及體積分?jǐn)?shù)1% 的青霉素-鏈霉素溶液，MCF-7/ADR 的培養(yǎng)需額外添加1 μmol/L DOX 以維持耐藥性。細(xì)胞置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中培育。

1.2 測試與表征

紫外-可見光譜（UV-vis）使用Cary 50 型紫外分光光度儀測定；元素分析（EA）采用Elementar III Vario EI 型分析儀測定；電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP-OES）采用Agilent 725 型光譜儀測定；紅外光譜（IR）通過Bruker Vortex 10 型在波長4 000～400 cm?1范圍內(nèi)測定；細(xì)胞毒性和ATP 含量檢測通過Biotek Synergy H1 型多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測定；細(xì)胞成像通過Nikon Eclips Ti-S 型熒光顯微鏡拍攝完成。

1.3 實驗步驟

1.3.1 槲皮苷金屬配合物Cu-Quercitrin 和Zn-Quer citrin 的合成及表征 稱取一水合醋酸銅（0.08 mmol，17.8 mg）溶于8 mL 水中，逐滴加入到槲皮苷（0.04 mmol，20 mg）的甲醇溶液（20 mL）中。將反應(yīng)溶液加熱至60 ℃，攪拌回流反應(yīng)24 h，得到棕黃色渾濁液。過濾，濾渣用甲醇洗滌3 次后真空干燥得到棕黃色產(chǎn)物16 mg，產(chǎn)率為50%。Anal. Cacl. for C27H36Cu2O19:C 40.96%; H 4.58%; Cu 16.05%。Found: C 40.55%;H 4.19%; Cu 15.6%。IR（KBr，ν）: 3 391、2 931、1 624、1 573、1 476、1 352、1 270、1 204、1 092、1 059、995、959、810、629 cm?1。UV（DMSO, 二甲基亞砜）:287 、 450 nm 和675 nm。

稱取醋酸鋅（0.08 mmol，14.7 mg）溶于8 mL 水中，逐滴加入到槲皮苷（0.04 mmol，20 mg）的甲醇溶液（20 mL）中。將反應(yīng)溶液加熱至60 ℃，攪拌回流反應(yīng)24 h，得到黃色渾濁溶液。過濾，濾渣用甲醇洗滌3 次后真空干燥得到黃色產(chǎn)物6 mg，產(chǎn)率20%。Anal. Cacl. for C25H32Zn2O19: C 39.13%; H 4.20%;Zn 17.04%。Found: C 38.69%; H 3.83%; Zn 18%。IR（KBr，ν）: 3 408、2 932、1 622、1 575、1 476、1 352、1 271、1 202、1 089、1 060、996、964、807、620 cm?1。UV（DMSO, 二甲基亞砜）：270 、 431 nm。

1.3.2 Rh123 和DOX 細(xì)胞中累積的檢測 取干凈的蓋玻片置于24 孔板中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的明膠包備4 h 后，將MCF-7/ADR 或MCF-7 細(xì)胞以1.5×105個/mL 的細(xì)胞密度分別接種于24 孔板中，貼壁。分別加入濃度均為0、10、30、50 μmol/L 的槲皮苷，槲皮苷金屬配合物Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin， 以及50 μmol/L 維拉帕米的無血清的MCF-7/ADR 或MCF-7 培養(yǎng)基，置于37 °C 培養(yǎng)箱中共培育12 h，然后吸出培養(yǎng)基，加入10 μmol/L Rh123 或10 μmol/L DOX 的無血清培養(yǎng)基培育30 min。細(xì)胞經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定后制片并拍照。Rh123 在藍(lán)光激發(fā)下可以呈現(xiàn)出綠色熒光，DOX 在綠光激發(fā)下可以呈現(xiàn)出紅色熒光。

1.3.3 MTT 檢 測DOX 的 細(xì)胞毒性 MCF-7/ADR 細(xì)胞以1.5×105個 /mL 的細(xì)胞密度分別接種于96 孔板中，24 h 貼壁。分別加入濃度為0、10、30、50 μmol/L的Cu-Quercitrin 與MCF-7/ADR 細(xì)胞共培育12 h，再加入0、30 和50 μmol/L 的DOX 共培育12 h。最后加入 20 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液培育4 h、120 μL DMSO 溶解紫色結(jié)晶后通過酶標(biāo)儀檢測570 nm 處的吸光度A（A=Atotal－Ablank, 其中Atotal為實驗組檢測的吸收值，Ablank為空白對照組(未生長細(xì)胞) 測定的吸收值）。其中未加藥組細(xì)胞存活率設(shè)為1，其570 nm處吸光值為A0，加藥組各檢測孔570 nm 處吸光值為A，A/A0即為MCF-7/ADR 細(xì)胞的存活率。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法 (Western-Blot) MCF-7/ADR細(xì)胞以1×105個 /mL 的細(xì)胞密度、毎孔2 mL 分別接種于6 孔板中，24 h 貼壁。分別加入濃度為0、10、30、50 μmol/L 的Cu-Quercitrin 與MCF-7/ADR 細(xì) 胞共培育12 h 后，置于冰上進(jìn)行細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解物在4 °C、12 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液。BCA 蛋白檢測試劑盒測定各個樣品蛋白的濃度，每個蛋白樣品取10 μg 的進(jìn)樣量，進(jìn)行SDSPAGE 電泳（分離膠體積分?jǐn)?shù)為8%）。然后，通過轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF 膜，其中蛋白正面朝上，TBST(Tris(hydroxymethyl) aminomethane)緩沖液洗3 次，每次10 min。再將膜置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的脫脂牛奶中進(jìn)行封閉，在室溫環(huán)境下緩慢搖動1 h。之后將膜置于體積比1∶5 000 稀釋的P-gp 一抗中，4 °C 孵育過夜。一抗孵育后的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用TBST 緩沖液清洗4 次，每次5 min，再將膜置于體積比1∶3 000 稀釋的二抗中，室溫環(huán)境下孵育1 h。二抗孵育后的PVDF 膜用TBST 緩沖液洗滌5 次，每次10 min，將膜上未結(jié)合的二抗清洗干凈。PVDF 膜經(jīng)超敏ECL（Electro-Chemi-Luminescence）化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色，并置于暗室中顯色進(jìn)行拍照。

1.3.5 細(xì)胞中ATP 含量檢測 MCF-7/ADR 和MCF-7 細(xì)胞以1×105個 /mL 的細(xì)胞密度，毎孔2 mL 分別接種于6 孔板中，24 h 貼壁。分別加入濃度為0、10、30、50 μmol/L 的Cu-Quercitrin 及50 μmol/L 維拉帕米與細(xì)胞共培育12 h。12 h 后，6 孔板中每孔加入200 μL ATP 檢測裂解液，置于冰上進(jìn)行細(xì)胞裂解。細(xì)胞裂解物在4 °C、12 000 r/min 條件下離心5 min，取上清液。采用ATP 檢測試劑盒在多功能酶標(biāo)儀中檢測蛋白中ATP 含量的變化。同時采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定各個樣品中蛋白的濃度。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析方法 在Excel 中通過T-test 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中*P < 0.05，**P < 0.01，***P <0.001（P 為計算所得的統(tǒng)計學(xué)概率）。

圖 1 Cu-Quercitrin、Zn-Quercitrin 和Quercitrin 的紫外吸收光譜（a），紅外光譜（b）；Cu-Quercitrin（c）和Zn-Quercitrin（d）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 UV-vis spectra (a), FT-IR spectra (b) of Cu-Quercitrin, Zn-Quercitrin and Quercitrin; Chemical structures of Cu-Quercitrin (c) and Zn-Quercitrin (d)

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 的表征和結(jié)構(gòu)

圖1（a）所示為Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 溶解于DMSO 中的紫外-可見吸收光譜。配體槲皮苷在考察范圍內(nèi)有兩個重要吸收峰，其中357 nm 處的吸收峰是來自槲皮苷中的肉桂酰共軛體系，260 nm處的吸收峰屬于槲皮苷結(jié)構(gòu)中苯甲酰共軛體系。從圖中可以看出，Cu-Quercitrin 吸收峰在287 nm 和450 nm處，Zn-Quercitrin 吸收峰在270 nm 和431 nm 處，即配體槲皮苷中苯甲酰和肉桂酰共軛體系的吸收峰均發(fā)生不同程度的紅移，初步表明槲皮苷中苯甲酰共軛體系的羥基和羰基及肉桂酰共軛體系中鄰酚羥基都參與金屬離子配位。此外，Cu-Quercitrin 在675 nm處有一個吸收峰，屬于Cu-Quercitrin中Cu2+八面體幾何構(gòu)型的特征吸收峰[18]。根據(jù)朗伯-比爾定律，測得槲皮苷銅配合物Cu-Quercitrin 在675 nm 處的摩爾吸光系數(shù)（λ）為473 L/(mol·cm)。

圖1（b）所 示 為Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin的紅外光譜，Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 分別在3 391 cm?1和3 416 cm?1處有一個特征寬帶峰，屬于槲皮苷中OH 基團和配位水分子中的O―H 伸縮振動峰[19]。相比于槲皮苷在3 268 cm?1處的羥基特征帶，Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 的羥基特征峰分別向高頻率移動了123 cm?1和148 cm?1，表明槲皮苷中鄰酚羥基參與配位。另外槲皮苷中1 657 cm?1處的C＝O 在槲皮苷金屬配合物Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin中分別轉(zhuǎn)移到低頻率的1 624 cm?1和1 622 cm?1處，表明槲皮苷中羰基氧原子參與配位。另外，C－O－C在1 270 cm?1處的伸縮振動峰和C＝ C 在1 573 cm?1處的伸縮振動峰并沒有發(fā)生明顯位移，表明配體槲皮苷中環(huán)氧沒有參與金屬配位。Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1（c）～（d），其中兩個水分子和甲醇分子參與Cu-Quercitrin 的配位，四個水分子參與Zn-Quercitrin 的配位。綜合譜圖特征說明Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，但是沒有晶體結(jié)構(gòu)，不排除它們的立體結(jié)構(gòu)有差異。

2.2 槲皮苷金屬配合物Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin的P-gp 抑制活性

2.2.1 Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin 對Rh123 和DOX在MCF-7/ADR 細(xì)胞中累積的影響 Rh123 和DOX作為P-gp 的底物，會通過P-gp 轉(zhuǎn)運而被排出細(xì)胞，在P-gp 過表達(dá)的細(xì)胞中難以積累到一定濃度。按照1.3.2 節(jié)方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2 和圖3 所示。與對照組和槲皮苷實驗組相比，Cu-Quercitrin 處理的MCF-7/ADR 細(xì)胞中Rh123 和DOX 的熒光強度有明顯增強，并且增強趨勢呈濃度依賴性，Cu-Quercitrin的作用濃度越高，細(xì)胞中Rh123 和DOX 的熒光越強。在Cu-Quercitrin 的濃度為30 μmol/L 和50 μmol/L時，細(xì)胞中Rh123 的綠色熒光和DOX 的紅色熒光明顯強于配體槲皮苷和P-gp 抑制劑作用的細(xì)胞。但是Zn-Quercitrin 對Rh123 和DOX 在耐藥細(xì)胞中積累的作用相對Cu-Quercitrin 的積累作用較弱。這可能與兩種配合物的立體結(jié)構(gòu)有關(guān)。這些結(jié)果表明槲皮苷與銅離子配位后，其活性得到明顯提高，Rh123和DOX 在耐藥細(xì)胞中積累明顯增加。初步推測Cu-Quercitrin 對P-gp 轉(zhuǎn)運可能具有抑制作用，且其抑制作用要強于P-gp 抑制劑維拉帕米。

2.2.2 Cu-Quercitrin 對Rh123 和DOX 在MCF-7 細(xì)胞中的積累 Cu-Quercitrin 可以增加Rh123 和DOX 在耐藥株MCF-7/ADR 細(xì)胞中的積累，因此探究了Cu-Quercitrin 對Rh123 和DOX 在野生株MCF-7 細(xì)胞中積累的影響，結(jié)果如圖4 所示。表明Cu-Quercitrin對Rh123 和DOX 在MCF-7 細(xì)胞中的積累沒有明顯影響。Cu-Quercitrin 可以增加耐藥株MCF-7/ADR 細(xì)胞中Rh123 和DOX 的積累（圖2 和圖3），但不會影響在野生株MCF-7 細(xì)胞中的積累，進(jìn)一步表明Cu-Quercitrin 可以明顯抑制P-gp 的轉(zhuǎn)運功能。

圖 2 Rh123 在MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)的積累Fig. 2 Accumulation of Rh123 in MCF-7/ADR cells

圖 3 DOX 在MCF-7/ADR 細(xì)胞內(nèi)的積累Fig. 3 Accumulation of DOX in MCF-7/ADR cells

圖 4 DOX 和Rh123 在MCF-7 細(xì)胞內(nèi)的積累Fig. 4 Accumulation of DOX and Rh123 in MCF-7 cells

圖 5 Cu-Quercitrin 對DOX 在MCF-7/ADR 細(xì)胞中細(xì)胞毒性的影響Fig. 5 Effect of Cu-Quercitrin on cytotoxicity of DOX in MCF-7/ADR cells

2.2.3 Cu-Quercitrin 對DOX 的細(xì)胞毒性的影響 在細(xì)胞DOX 熒光積累實驗中發(fā)現(xiàn)Cu-Quercitrin 可以明顯增加DOX 在MCF-7/ADR 細(xì)胞中的累積，因此通過MTT 實驗檢測Cu-Quercitrin 對DOX 在MCF-7/ADR 細(xì)胞中細(xì)胞毒性的影響，實驗結(jié)果如圖5 所示。對比黑色柱狀圖形可以看出Cu-Quercitrin 單獨處理的細(xì)胞中，隨著Cu-Quercitrin 作用濃度的增加，細(xì)胞存活率有所下降，但仍表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性；在Cu-Quercitrin 的濃度為0 時（紅色柱狀圖）可以看出DOX 有較低的細(xì)胞毒性，這是基于MCF-7/ADR對DOX 耐藥性的結(jié)果。但是Cu-Quercitrin與MCF-7/ADR 細(xì)胞共培育12 h 后，DOX 再作用于細(xì)胞時，細(xì)胞存活率有明顯下降，且Cu-Quercitrin 的濃度越高，細(xì)胞存活率越低。表明Cu-Quercitrin 通過抑制P-gp轉(zhuǎn)運功能，增加DOX 在細(xì)胞中的積累，提高M(jìn)CF-7/ADR 細(xì)胞對DOX 的敏感性，從而增強DOX 在細(xì)胞內(nèi)的累積毒性，緩解P-gp 介導(dǎo)的細(xì)胞多藥耐藥?；谝陨蠈嶒灲Y(jié)果，Cu-Quercitrin 在30 μmol/L 濃度下表現(xiàn)出較強的P-gp 轉(zhuǎn)運功能的抑制作用和較低的細(xì)胞毒性，因此目前實驗條件下Cu-Quercitrin 的最優(yōu)作用濃度為30 μmol/L/。

2.3 Cu-Quercitrin 的P-gp 抑制機制的研究

2.3.1 Cu-Quercitrin 對P-gp 在蛋白水平表達(dá)的影響P-gp 抑制劑一般是通過降低P-gp 的蛋白水平、RNA 水平的表達(dá)，或者通過影響細(xì)胞的ATP 的含量，進(jìn)而影響P-gp 的轉(zhuǎn)運功能[20]。MCF-7/ADR 細(xì)胞與0、10、30、50 μmol/L 的 Cu-Quercitrin 共培育12 h后，裂解細(xì)胞并提取總蛋白。通過Western-Blot 分離條帶轉(zhuǎn)膜后，Tanon 化學(xué)發(fā)光照膠儀采集圖像如圖6(a)所示，其中上面條帶為目標(biāo)蛋白P-gp，下面條帶為內(nèi)參蛋白Tubulin。圖6（b）所示為由Tanon Gis 分析軟件得出的條帶分析結(jié)果。從圖中可以看出Cu-Quercitrin 對細(xì)胞中P-gp 蛋白水平的表達(dá)沒有明顯影響，表明Cu-Quercitrin 并不會通過影響Pgp 蛋白水平的表達(dá)抑制P-gp 轉(zhuǎn)運功能。

圖 6 Cu-Quercitrin 對P-gp 在MCF-7/ADR 細(xì)胞中表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of Cu-Quercitrin on the expression of P-gp in MCF-7/ADR cells

2.3.2 Cu-Quercitrin 對細(xì)胞中ATP 含量的影響 P-gp作為一種能量依賴的跨膜藥物外輸泵，在將外源性物質(zhì)逆濃度從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外的過程中需要ATP 水解釋放能量。因此，ATP 對于P-gp 的轉(zhuǎn)運功能至關(guān)重要，一旦細(xì)胞內(nèi)ATP 含量發(fā)生變化，必然會影響P-gp 的轉(zhuǎn)運功能。例如P-gp 抑制劑中GF-120918，LY-335979 和XR9576 等第三代抑制劑以及黃酮類化合物都可以通過影響ATP 含量抑制Pgp 藥物轉(zhuǎn)運功能[20]。因此，考察了Cu-Quercitrin 對細(xì)胞中ATP 含量的影響。

使用ATP 檢測試劑盒（ATP Assay Kit）檢測了Cu-Quercitrin 對細(xì)胞中ATP 含量的影響。當(dāng)用0、10、30、50 μmol/L 的 檞皮苷、Cu-Quercitrin 及50 μmol/L的維拉帕米與MCF-7/ADR 和MCF-7 細(xì)胞分別共培育12 h 后，裂解細(xì)胞后提取總蛋白，基于ATP 檢測試劑盒測定熒光素的熒光值與ATP 含量成正比，從而反映細(xì)胞中ATP 含量的變化，結(jié)果如圖7 所示。從圖7（a）中可以看出，與配體檞皮苷相比，Cu-Quercitrin 可以明顯降低MCF-7/ADR 細(xì)胞中單位蛋白的ATP 含量。隨著培養(yǎng)基中Cu-Quercitrin 濃度的增加，MCF-7/ADR 細(xì)胞中單位蛋白的ATP 含量逐步降低，而且明顯低于使用同等濃度的P-gp 抑制劑。與之對應(yīng)的是Cu-Quercitrin 對MCF-7 細(xì)胞中ATP含量沒有明顯影響（圖7（b））。這與Cu-Quercitrin能夠影響P-gp 底物在耐藥細(xì)胞中的積累，但不會影響在非耐藥細(xì)胞中的積累結(jié)果一致。與MCF-7 細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR 中P-gp 往往過度表達(dá)，而P-gp 結(jié)構(gòu)中核苷酸結(jié)合位點參與ATP 水解釋放能量，進(jìn)而推動P-gp 的轉(zhuǎn)運功能。這一結(jié)果表明Cu-Quercitrin 可能通過降低耐藥細(xì)胞中ATP 含量，減少P-gp 轉(zhuǎn)運功能所需的能力，進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)運功能。

圖 7 Cu-Quercitrin 對MCF-7/ADR 細(xì)胞（a）和MCF-7 細(xì)胞（b）中ATP 含量的影響Fig. 7 Effect of Cu-Quercitrin on the ATP content in MCF-7/ADR (a) and MCF-7 (b) cells

3 結(jié) 論

合成了槲皮苷金屬配合物Cu-Quercitrin 和Zn-Quercitrin，探究了其P-gp 抑制活性。Cu-Quercitrin可以明顯增加P-gp 底物Rh123 和DOX 在耐藥細(xì)胞中的累積，但是對非耐藥細(xì)胞沒有明顯影響。相比于Cu-Quercitrin，Zn-Quercitrin 對Rh123 和DOX 在耐藥細(xì)胞中積累的作用較弱。這一實驗結(jié)果初步表明Cu-Quercitrin 具有抑制P-gp 轉(zhuǎn)運功能的作用，而且其抑制作用比同等濃度的維拉帕米強。同時Cu-Quercitrin 增強DOX 對耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒性的實驗結(jié)果也證明Cu-Quercitrin 抑制P-gp 藥物外排功能，增加了抗癌藥物在耐藥細(xì)胞中的累積。通過進(jìn)一步對Cu-Quercitrin 抑制P-gp 轉(zhuǎn)運功能的機制研究發(fā)現(xiàn)，Cu-Quercitrin 對P-gp 蛋白水平的表達(dá)沒有影響，但是能降低耐藥細(xì)胞中ATP 含量，且降低趨勢也明顯高于維拉帕米。因此，Cu-Quercitrin 有望成為一種新型的P-gp 抑制劑。