邢 幸， 康 寧， 曾 天， 徐云龍

（1. 華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海200237；2. 上海微納科技有限公司，上海 200237）

隨著細(xì)菌耐藥性[1-2]的增加迫切需要一種具有非特異性作用模式且不產(chǎn)生耐藥菌的抗菌藥物；銀、銅等金屬粒子雖然殺菌能力強(qiáng)但細(xì)胞毒性大[3-4]。本文選用不產(chǎn)生耐藥菌且細(xì)胞毒性低的茶樹油(TTO)和鹽酸奧替尼啶(OCT) 作為抗菌藥。TTO 是迄今為止發(fā)現(xiàn)的殺菌效果最強(qiáng)的天然抗菌劑之一，抗菌廣譜、抗菌活性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低。TTO 抗菌性依賴于其親油性的碳?xì)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞[5-6]。雙子乳化劑OCT 是一種雙吡啶胺類廣譜抗菌藥，它有兩個(gè)相距較遠(yuǎn)且互不干擾的陽離子活性中心，具有更強(qiáng)的吸附能力及更高的荷電特性，從而更易改變細(xì)胞壁原生質(zhì)膜的滲透性以殺死細(xì)菌[7-8]。OCT 對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率為醋酸氯已定的3～10 倍，并且不產(chǎn)生耐藥性[9]。Hübner 等[10]在首次體外抗菌研究中證實(shí)OCT 和抗生素聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同增效作用，而不像醋酸氯已定一樣產(chǎn)生拮抗作用。Müller 等[11]通過比較9 種常見抗菌藥對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抗菌性能和對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)生相同的殺菌效果時(shí)OCT的濃度最低且細(xì)胞毒性最小。

TTO 的缺點(diǎn)是易揮發(fā)、不穩(wěn)定，其中的萜烯類有效成分易被氧化[12]，高濃度時(shí)刺激傷口[13-14]。為了提高TTO 的穩(wěn)定性、降低TTO 釋放濃度、延長(zhǎng)TTO 釋放時(shí)間，本文將其包封于納米二氧化硅膠囊中。納米二氧化硅膠囊具有高的比表面積（載藥量比介孔納米二氧化硅大3～5 倍）、可控的尺寸[15-16]、良好的力學(xué)性能、化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性[17]。納米膠囊還具有控制藥物釋放速率，保護(hù)藥物不被外界環(huán)境破壞，增加揮發(fā)性油的穩(wěn)定性等作用[18-20]。

本文研究TTO 與OCT 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的聯(lián)合抗菌作用，成功制備出一種同時(shí)具有TTO 和OCT 兩種抗菌劑的納米二氧化硅膠囊SINCOCT/TTO，并與乳化劑十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）制備的納米膠囊SINC-TTO 在形貌、粒徑分布、比表面積、載藥量、體外釋藥、抗菌性等方面進(jìn)行比較。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試 劑

十六烷基三甲基氯化銨(分析純，純度99%)，阿拉丁試劑有限公司；正十六烷(HE, Hexadecane, 分析純，純度99%)，阿拉丁試劑有限公司；茶樹油(純度100%)，AA 英國(guó)護(hù)膚品公司；鹽酸奧替尼定(分析純，純度98%)，畢得醫(yī)藥有限公司；正硅酸乙酯(TEOS，純度98%)、橄欖油(OO, 分析純，純度100%)，上海麥克林生化試劑有限公司；牛肉浸膏(生物試劑)、瓊脂粉(生物試劑)、蛋白胨(生物試劑)，上海天蓮化工科技有限公司；吐溫-80(化學(xué)純)、氯化鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鉀(分析純)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；金黃色葡萄球菌（ATCC65388）、大腸桿菌（CCTCC AB 93154），上海瑞普生物科技有限公司；去離子水實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 二氧化硅載藥納米膠囊的制備

采用微乳液模板界面水解縮合硅氧烷的方法制備包裹油性藥物二氧化硅納米膠囊。稱取2 g TEOS、1 g TTO 與125 mg HE 混合，加入30 mL、 0.77 mg/mL對(duì)應(yīng)的CTAC 或OCT 水溶液，以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速于室溫?cái)嚢? h 進(jìn)行預(yù)乳化。將超聲細(xì)胞粉碎機(jī)功率調(diào)到450 W，振幅調(diào)到50%，使用6#變幅桿(30 s 超聲、10 s 暫停)在冰水浴連續(xù)超聲180 s 獲得微乳液，隨后以1 000 r/min 的攪拌速度于室溫?cái)嚢?2 h，預(yù)冷凍8 h 后，用冷凍干燥機(jī)凍干。以O(shè)O 為油核、OCT為乳化劑，用相同的方法和配比制備納米膠囊SINCOCT。

1.3 載藥納米二氧化硅膠囊的形貌和結(jié)構(gòu)表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，Nicolet is50 型，美國(guó)熱電公司）對(duì)納米膠囊中的藥物成分進(jìn)行分析，納米膠囊分散液預(yù)冷凍8 h 后于冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N 型，寧波新芝）中凍干，凍干粉末采用KBr 壓片的方法制樣，茶樹油涂在KBr 鹽片上制樣。用綜合熱分析儀（TGA，STA-409PC 型，德國(guó)耐馳公司）測(cè)定納米膠囊熱重曲線來確定納米膠囊中包裹的茶樹油含量。納米膠囊的水合粒徑采用動(dòng)態(tài)光散射儀（DLS，ZEN-3700 型，英國(guó)馬爾文公司）測(cè)定。采用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800 型，日本日立公司）和透射電子顯微鏡（TEM，JEM-1400型，日本電子株式會(huì)社）對(duì)納米二氧化硅微膠囊進(jìn)行形貌表征。采用酶標(biāo)儀（AMAX384 型，美國(guó)分子器件公司）測(cè)試茶樹油和鹽酸奧替尼啶兩種藥物單獨(dú)作用與聯(lián)合作用時(shí)混合反應(yīng)液的吸光度（OD）值。用紫外分光光度計(jì)（UV-vis，UV-3600 型，日本島津公司）測(cè)試納米膠囊的釋藥性能。采用比表面積及孔隙度分析儀(ASAP-2460 型，美國(guó)麥克儀器公司)在液氮溫度?196 ℃下測(cè)定樣品的吸附-脫附等溫線，基于吸附-脫附等溫線，采用BET（Brunauer Emmett Teller ）法計(jì)算樣品的比表面積，通過BJH 模型估算得到樣品的孔徑分布曲線。BET 制樣方法：將納米膠囊凍干粉放置于馬弗爐中以4 °C/min 升溫至400 °C，保溫5 h，隨后在200 °C 的真空干燥箱內(nèi)脫氣12 h。

1.4 茶樹油和鹽酸奧替尼啶單獨(dú)作用與聯(lián)合作用時(shí)的最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定[20]

選用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)作為抗菌實(shí)驗(yàn)的菌種。配制液態(tài)培養(yǎng)基[21](GBl5979―2002)，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配制0.5 麥?zhǔn)媳葷釢舛染鷳乙旱? 000 倍稀釋液(細(xì)菌濃度約為1.5×105cfu/mL)。取96 孔板，在其中A、B 排每孔添加90 μL 液態(tài)培養(yǎng)基，隨后在A、B 排第1 個(gè)孔加入90 μL 初始質(zhì)量濃度為10 mg/mL 抗菌劑TTO(體積分?jǐn)?shù)5%的吐溫?80 水溶液)[22]，采用對(duì)倍稀釋法逐步稀釋，隨后在每個(gè)孔滴加入10 μL 菌懸液 (液體總體積為100 μL)。C、D 排步驟同上，抗菌劑為初始質(zhì)量濃度770 μg/mL 的OCT溶液。在同一個(gè)96 孔板中，有4 個(gè)孔只加液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，4 個(gè)孔只加液體培養(yǎng)基和菌懸液作為陽性對(duì)照。在37 ℃振蕩搖床中培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀讀取600 nm 處的吸光度OD600，每次測(cè)試2 個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。每個(gè)孔的細(xì)菌生長(zhǎng)率S 通過式(1)計(jì)算。然后將所得數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖，得到抗菌藥物的MIC。

其中：MICTTO-unite為聯(lián)合用藥時(shí)TTO 的MIC；MICOCT-unite為聯(lián)合用藥時(shí)OCT 的MIC；MICTTO為TTO 單獨(dú)用藥時(shí)的MIC；MICOCT為OCT 單獨(dú)用藥時(shí)的MIC。判斷方法為：FIFC≤0.5，協(xié)同作用；0.5

1.5 載藥納米膠囊釋藥性能測(cè)試

測(cè)定兩種納米膠囊中抗菌藥物TTO 的釋放質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線。配制體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇的PBS 溶液。取50 mg 凍干納米膠囊粉末于透析袋中，另取1 mL 透析液于透析袋中作為內(nèi)液，9 mL 透析液作為外液。在固定的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)取出0.4 mL 外液，測(cè)其在264 nm 處吸光度，隨后外液補(bǔ)充0.4 mL 透析液。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出TTO 的質(zhì)量濃度[24]，繪制出TTO 質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線。

測(cè)定SINC-OCT/TTO 中的OCT 釋放質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線。測(cè)試方法同上，測(cè)定281 nm處的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出OCT 的質(zhì)量濃度，繪制出OCT 質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線。

1.6 載藥納米膠囊的抗菌性測(cè)試

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)試納米膠囊的殺菌性能。實(shí)驗(yàn)前所有玻璃儀器在121 ℃下滅菌30 min。取8 個(gè)試管，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F、G、H。每個(gè)試管加入5 mL PBS 溶液，滴加10 μL 0.5 麥?zhǔn)媳葷釢舛鹊木鷳乙旱? 000 倍稀釋液（其中A、C、E、G 滴加金黃色葡萄球菌，B、D、F、H 滴加大腸桿菌）。A、B 試管分別加入10 mg SINC-TTO，C、D 試管分別加入10 mg SINC-OCT/TTO，E、F 試管分別加入10 mg SINC-OCT，G、H 組為陽性對(duì)照組，不加抗菌納米膠囊?；旌弦悍謩e置于搖床中室溫振蕩反應(yīng)1、3、6 h，并分別于1、3、6 h 吸取10 μL 混合液接種平板，將15 mL 冷卻至40～45 ℃瓊脂培養(yǎng)基傾注于平板中轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h 后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 載藥納米膠囊的合成流程及其形貌和結(jié)構(gòu)表征

以溶有陽離子乳化劑OCT 或CTAC 的水溶液為連續(xù)相，TTO、HE、TEOS 為分散相，利用超聲處理將分散相轉(zhuǎn)化為微乳液。隨后以微乳液滴為模板，TEOS 在微乳液滴表面水解縮聚成Si―O―Si 結(jié)構(gòu)，將TTO 封裝于納米膠囊核心 (圖1)，SINC-TTO 和SINC-OCT/TTO 的粒徑分布曲線見圖2，由圖2 可知，SINC-TTO、SINC-OCT/TTO 的 流 體 力 學(xué) 直 徑(dn)分別為67.36、121.7 nm。由掃描電鏡(圖3 (a1),3 (b1), 3 (c1))、透射電鏡(圖3 (a2), 3 (a3), 3 (b2), 3 (b3),3 (c2), 3 (c3))可見納米膠囊成空心球狀結(jié)構(gòu)，球殼厚度約為6～10 nm，SINC-OCT/TTO 的分散性好于SINC-TTO。這是由于SINC-OCT/TTO 使用雙子乳化劑OCT，其電荷密度更高，靜電排斥力更強(qiáng)，因此分散性更好。以沒有抗菌性能的OO 作為油核，用乳化劑OCT 制備的納米膠囊為SINC-OCT。由圖3 可見使用OO 制備的納米膠囊比使用TTO 制備的納米膠囊分散性差、結(jié)構(gòu)完整性差。這說明油的種類對(duì)納米膠囊的制備存在影響。

圖 1 微乳液法合成二氧化硅納米膠囊的原理圖Fig. 1 Schematic illustration of the synthesis of silica nanocapsules(SINCs) by using miniemulsion

圖 2 SINC-TTO，SINC-OCT/TTO 粒徑分布曲線Fig. 2 Particle size distribution of SINC-TTO and SINC-OCT/TTO

微乳化時(shí)兩相界面處乳化劑并未完全充滿，而是有油水滲入其中，油水滲入位置形成孔洞[25]。由SINC-TTO，SINC-OCT/TTO 氮?dú)馕?脫附曲線（圖4）可見兩種納米膠囊存在介孔結(jié)構(gòu)，滯回環(huán)形狀表明孔洞形狀為狹縫狀孔與墨水瓶狀孔的組合[26]，TEM 圖也證實(shí)了納米膠囊呈現(xiàn)空心球狀結(jié)構(gòu)。表面活性劑的種類影響到納米膠囊的粒徑、孔徑、載藥量、比表面積。與傳統(tǒng)乳化劑CTAC 相比，擁有更高的正電荷密度的雙子乳化劑OCT 與帶負(fù)電的SiO2有強(qiáng)烈的靜電吸引作用，導(dǎo)致Si―O―Si 殼體密度增加、孔徑減小、比表面積增加(表1)。納米膠囊的載藥量與其比表面積成正比。實(shí)驗(yàn)中加入HE 的目的是縮小膠囊尺寸實(shí)現(xiàn)微乳化[17]。

圖5 (a)示出了兩種納米膠囊（SINCS）凍干粉末的熱重分析曲線。曲線可以分為兩個(gè)階段，第1 階段25～108 °C，此時(shí)質(zhì)量損失為3.8%、6.1%，這是由于部分殘留水分揮發(fā)導(dǎo)致。第2 階段108～900 °C，此時(shí)質(zhì)量損失分別為33.3%、47.7%，這是TTO 的揮發(fā)和碳化。由此可以確定兩種載藥納米膠囊的TTO 含量分別約為33.3%、47.7%。以O(shè)CT 作為乳化劑合成的納米膠囊中TTO 的含量高于以CTAC 為乳化劑合成的納米膠囊。SINC-TTO 熱重曲線較SINC-OCT/TTO 有明顯的滯后，這可能是由于納米膠囊SINCTTO 的凍干粉團(tuán)聚結(jié)塊分散性比SINC-OCT/TTO 差(圖3)。多孔材料的載藥量與比表面積成正比，納米膠囊SINC-TTO 的比表面積小，載藥量比SINC-OCT/TTO 少(表1、圖5 (a))。

圖 3 SINC-TTO，SINC-OCT/TTO，SINC-OCT 納米膠囊的掃描電鏡與透射電鏡照片F(xiàn)ig. 3 SEM and TEM micrographs of the SINC-TTO, SINC-OCT/TTO and SINC-OCT

圖 4 SINC-TTO，SINC-OCT/TTO 的氮?dú)馕?脫附曲線Fig. 4 N2 adsorption-desorption isotherms of SINC-TTO and SINC-OCT/TTO

表 1 兩種用不同表面活性劑合成的包裹茶樹油納米膠囊的流體力學(xué)直徑、包油率、比表面積、孔徑Table 1 Hydrodynamic diameters, encapsulation efficiency, surface area and mean pore diameter of silica nanocapsules containing tea tree oil stabilized by different surfactants

圖5（b）示出了茶樹油、二氧化硅及兩種載藥膠囊的紅外光譜圖。從紅外光譜確認(rèn)兩種納米膠囊中含有TTO 成分，其中1 095 cm?1處是SiO2中 Si―O―Si反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收帶，1 072.85、1 077.94 cm?1處是SINC-TTO、SINC-OCT/TTO 中的Si―O―Si 反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收帶[27-28]。944.6、803 cm?1處分別是SiO2、SINC-TTO、SINC-OCT/TTO 中的Si―OH 彎曲振動(dòng)吸收峰、Si―O 對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。462.3、456.2 cm?1處 分 別 是SiO2、SINC-TTO、SINC-OCT/TTO 中的Si―O 對(duì)稱彎曲振動(dòng)吸收峰[27-28]?？梢?，納米膠囊殼中含有SiO2。同時(shí)，TTO 的紅外光譜中的峰（2 958 cm?1處為―CH3反對(duì)稱伸縮振動(dòng)、2 925 cm?1處為―CH3伸縮振動(dòng)、2 871 cm?1處為―CH2對(duì)稱伸縮振動(dòng)）是TTO 的特征峰。SINC-TTO、SINC-OCT/TTO 中的2 951、2 924 、2 857.8 cm?1處的峰均是TTO 的特征峰，由此可以確定兩種載藥納米膠囊中均含有茶樹油成分。

2.2 兩種抗菌藥物最小抑菌濃度MIC

圖 5 (a) 兩種載藥納米膠囊凍干粉末的熱重分析曲線；(b) 茶樹油、二氧化硅及兩種載藥膠囊紅外光譜圖Fig. 5 (a) TGA curves of freeze dried SINCs; (b) FT-IR spectra of TTO, SiO2, two kinds of SINCs

通過測(cè)試TTO、OCT 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度MIC 來比較TTO 和OCT 的抑菌性能，并為證明納米膠囊中OCT 與TTO 的協(xié)同抗菌作用提供依據(jù)。圖6 示出了兩種藥物單獨(dú)作用與聯(lián)合作用時(shí)藥物濃度與細(xì)菌存活率的關(guān)系。TTO 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MICTTO分別為1.25、2.5 mg/mL(圖6 (a),(b))；OCT 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MICOCT分別為3、6 μg/mL(圖6 (c),(d))?？梢奜CT 對(duì)兩種菌的MIC 都遠(yuǎn)小于TTO，并且兩種抗菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力均強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的抑菌能力。

TTO 與OCT 聯(lián)用時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MICTTO-unite為0.31、1.25 mg/mL，MICOCT-unite為0.75、3 μg/mL (圖6 (e),(f))。通過測(cè)試兩種藥物單獨(dú)與聯(lián)合作用時(shí)的MIC，比較計(jì)算得出TTO 與OCT 聯(lián)合作用時(shí)對(duì)大腸桿菌的FITC=1，對(duì)金黃色葡萄球菌的FITC=0.49。所以TTO 與OCT 聯(lián)合作用時(shí)對(duì)大腸桿菌具有相加抗菌效應(yīng)，而對(duì)金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抗菌效應(yīng)。

2.3 納米膠囊的釋藥性能研究

TTO 和OCT 的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7 (a)、(b)所示，兩種納米膠囊的TTO 釋放質(zhì)量濃度對(duì)時(shí)間變化的曲線如圖7 (c)所示，SINC-TTO 中TTO 的釋放曲線在0～1 h較為陡峭，有部分TTO 被吸附在納米膠囊表面，在4 h質(zhì)量濃度達(dá)到最大值15.9 μg/mL。SINC-OCT/TTO在3 h 質(zhì)量濃度達(dá)到最大值22.8 μg/mL，隨后質(zhì)量濃度基本保持恒定，不斷有TTO 從膠囊中釋放補(bǔ)充。此時(shí)釋放到混合液中的TTO 質(zhì)量濃度低于MICTTO。納米膠囊的緩釋作用降低了TTO 的質(zhì)量濃度，避免了其對(duì)傷口的刺激，同時(shí)延長(zhǎng)了藥物的殺菌作用時(shí)間。SINC-OCT/TTO 的TTO 釋放速度大于SINC-TTO(圖7)，這是由于SINC-OCT/TTO 的比表面積大于SINC-TTO (表1)。

圖 6 兩種藥物單獨(dú)作用 (a, b, c, d) 與聯(lián)合作用 (e, f) 時(shí)藥物濃度與細(xì)菌存活率的關(guān)系Fig. 6 Relationship between the two kinds of drug alone (a, b, c, d) and combined (e, f) act on the bacterial concentration and the survival rate of bacterial

圖 7 (a) 茶樹油乙醇溶液和 (b) 鹽酸奧替尼啶水溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線; 兩種納米膠囊釋放的 (c) 茶樹油和 (d) 鹽酸奧替尼啶質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化曲線Fig. 7 Calibration curves for the determination of TTO in ethyl alcohol (a) and OCT in water (b); Release of (c) TTO and (d) OCT from SINCs

SINC-OCT/TTO 中的OCT 釋放質(zhì)量濃度隨時(shí)間變化曲線(圖7 (d))與其中的TTO 釋放類似，在3 h達(dá)到最大值0.85 μg/mL，隨后維持動(dòng)態(tài)平衡，此時(shí)釋放到混合液中的OCT 質(zhì)量濃度接近于MICOCT(圖6 (c), 6 (d))。納米膠囊不斷地補(bǔ)充由于新添加透析液造成的藥物質(zhì)量濃度的下降，使透析液中的藥物質(zhì)量濃度維持穩(wěn)定(圖7 (d))。通過測(cè)試透析液中的藥物質(zhì)量濃度隨時(shí)間的變化，并將透析液中的TTO、OCT 質(zhì)量濃度分別與MICTTO(圖6 (a), (b))、MICOCT(圖6 (c), (d))進(jìn)行比較，為接下來驗(yàn)證納米膠囊分散液的抗菌性測(cè)試中的TTO 與OCT 的協(xié)同抗菌作用提供依據(jù)(圖8 (a), (b))。

2.4 載藥納米膠囊分散液的抗菌性測(cè)試

Jiang 等[19]用CTAC 制備包裹OO 的納米膠囊時(shí)發(fā)現(xiàn)此時(shí)的納米膠囊并沒有抗菌性，這是因?yàn)榧{米膠囊在PBS 混合液中釋放的CTAC 的質(zhì)量濃度(3.9 μg/mL)遠(yuǎn)低于CTAC 的MIC (32 μg/mL)，所以本實(shí)驗(yàn)中CTAC 的抗菌性同樣不予考慮。SINCTTO 作為對(duì)照組納米膠囊只有一種抗菌藥TTO，SINC-OCT/TTO 有兩種抗菌藥TTO、OCT。

TTO、OCT 抗菌作用機(jī)理不同，不會(huì)因競(jìng)爭(zhēng)同一靶位產(chǎn)生拮抗作用。兩種納米膠囊在釋藥透析液中TTO 的質(zhì)量濃度相近，SINC-OCT/TTO 的釋藥透析液中含有一定質(zhì)量濃度的OCT(圖7 (d))，增強(qiáng)了SINC-OCT/TTO 的抗菌性能。圖8 示出了納米膠囊分散液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的殺菌率及殺菌效果。從圖中看出，用SINC-TTO、SINC-OCT/TTO、SINC-OCT 處理金黃色葡萄球菌懸液1 h 后細(xì)菌存活率分別下降到41.5%、6.7%、80%；處理的大腸桿菌懸液細(xì)菌存活率分別下降到83.8%、22.18%、88%。受到納米膠囊的控釋作用影響，抗菌實(shí)驗(yàn)中的PBS 緩沖液中的藥物質(zhì)量濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，菌落數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少。在同一時(shí)間點(diǎn)3 種納米膠囊的抗菌能力SINC-OCT/TTO>SINC-TTO>SINC-OCT。在3 h SINC-OCT/TTO 將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌全部殺滅。這是因?yàn)榕c只含有一種抗菌劑TTO 的SINC-TTO 相比，SINC-OCT/TTO 不僅TTO的包載率（47.7%）大于SINC-TTO（33.3%）(圖5 (a))，而且OCT 的抗菌能力高于TTO(圖 (6))；此外納米膠囊不斷補(bǔ)充消耗的抗菌劑，添加SINC-OCT/TTO 的PBS 緩沖液中藥物質(zhì)量濃度在3 h 達(dá)到最大值（圖7 (c),7 (d)）。不同細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)差異造成細(xì)菌耐藥性差異，大腸桿菌的耐藥性較強(qiáng)[29,30]，同時(shí)由于OCT 聯(lián)合TTO 對(duì)金黃色葡萄球菌的協(xié)同抗菌作用強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的相加抗菌作用，納米膠囊處理過的金黃色葡萄球菌的失活率高于大腸桿菌。

圖 8 不同SINCs 對(duì)金黃色葡萄球菌(a)和大腸桿菌(b)的滅活效率Fig. 8 Inactivation efficiency of S.aureus (a) and E. coli (b) in the presence of different SINCs

3 結(jié) 論

（1）TTO 是自然界中殺菌性能最強(qiáng)的天然產(chǎn)物，然而由于其穩(wěn)定性差、不溶于水、易揮發(fā)、易被紫外線氧化等缺陷限制了它的應(yīng)用。本文以不產(chǎn)生耐藥菌、殺菌能力強(qiáng)、細(xì)胞毒性低的TTO 為油核，TEOS為硅源，分別用兩種不同的乳化劑CTAC、OCT 制備了兩種納米膠囊。

（2）兩種納米膠囊均呈現(xiàn)空心球形結(jié)構(gòu)，平均直徑分別為67.36 nm 和121.7 nm。以雙子乳化劑OCT制備的茶樹油納米膠囊SINC-OCT/TTO 的TTO 包載率 (47.7%) 高于以傳統(tǒng)乳化劑CTAC 制備的納米膠囊SINC-TTO (33.3%)包載率，并且SINC-OCT/TTO的分散性好于SINC-TTO 的分散性。

（3）OCT 與TTO 聯(lián)合作用于金黃色葡萄球菌與大腸桿菌時(shí)分別起到協(xié)同與相加作用，兩種藥物聯(lián)用時(shí)無拮抗?？咕鷮?shí)驗(yàn)證明了SINC-OCT/TTO 的殺菌性能遠(yuǎn)強(qiáng)于SINC-TTO、SINC-OCT，SINC-TTO 的殺菌性能強(qiáng)于SINC-OCT。納米膠囊具有良好的藥物緩釋性能，納米膠囊的殺菌性能隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。微乳液法可以在合成的同時(shí)將藥物包裹于納米膠囊中，制備方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、應(yīng)用前景廣闊。