任晨曦，宮伊希，謝丹萍，劉悅，郭曉宇，申貴男，孫虎男

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，原癌細(xì)胞會(huì)在原發(fā)部位增殖生長(zhǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)到一定大小后，會(huì)侵潤(rùn)周圍組織的血管和淋巴，進(jìn)入血液后，隨血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到其他部位，繼續(xù)增殖生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)移性腫瘤。近年來(lái)，肺癌（Lung Cancer）的發(fā)病率與致死率居高不下，每年約有超過1 000 000人死亡，人類的生命健康受到嚴(yán)重的威脅[1]。肺癌在發(fā)展過程中，癌細(xì)胞的高增殖性與易轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致肺癌細(xì)胞極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，病情發(fā)展較快，患者確診時(shí)已到癌癥晚期，導(dǎo)致肺癌患者的存活率極低。依據(jù)組織病理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)，肺癌可分為兩種類型：一種為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC），另一種為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。臨床上最為常見的肺癌多為非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌患者約占肺癌患者總數(shù)的80%，非小細(xì)胞肺癌的快速增殖能力和高轉(zhuǎn)移性是最常見的致死原因[3]。然而傳統(tǒng)的手術(shù)治療和化學(xué)療法皆存在著副作用強(qiáng)、治療經(jīng)費(fèi)昂貴等一系列不足，因此，尋找一種可以有效抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的新方法迫在眉睫。

過氧化物還原酶（Peroxiredoxins，Prxs）是細(xì)胞內(nèi)的一類過氧化物酶[4-6]，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)六種Prx亞型：PrxI～VI。根據(jù)半胱氨酸殘基類型不同分為：含有兩個(gè)半胱氨酸殘基的典型Prx I～I(xiàn)V與非典型Prx V和含有一個(gè)半胱氨酸殘基的Prx VI[7]。在生理?xiàng)l件下，它們負(fù)責(zé)保護(hù)細(xì)胞免受DNA氧化損傷和基因組不穩(wěn)定，調(diào)節(jié)與H2O2相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)，影響細(xì)胞的分化和增殖，免疫反應(yīng)和凋亡[18]。過氧化物酶V（Peroxiredoxin，Prx V）是Prx家族中的一個(gè)成員。Prx V在細(xì)胞質(zhì)、線粒體以及過氧化物酶體中廣泛存在，能夠還原細(xì)胞內(nèi)過氧化氫，烷基氫過氧化物以及過氧亞硝酸鹽，清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧等[8-9]，對(duì)細(xì)胞質(zhì)、線粒體具有抗氧化的保護(hù)功能[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，Prx V在肝癌細(xì)胞[11]、結(jié)腸癌細(xì)胞[12]、胃癌細(xì)胞[13-14]凋亡過程中均具有調(diào)控作用，過量表達(dá)Prx V會(huì)通過上調(diào)Snail增加胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲性[15]；在結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)Prx V會(huì)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，在抑制Prx V后可以有效降低細(xì)胞的EMT（Epithelial-to-mesenchymal transition）特性[16]。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，Prx V的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞病灶形成、浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、晚期TNM分期有顯著的負(fù)相關(guān)性[17]。但是，Prx V對(duì)A549人肺癌細(xì)胞的各種生理活性的影響現(xiàn)今并無(wú)研究。

研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染A549人肺癌細(xì)胞系，構(gòu)建Prx V敲降的A549細(xì)胞系，對(duì)構(gòu)建的細(xì)胞系利用熒光顯微鏡和蛋白免疫印跡法進(jìn)行鑒定，通過MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、群落形成實(shí)驗(yàn)及蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖、遷移、群落形成能力和相關(guān)蛋白表達(dá)水平間的差異，初步闡明Prx V對(duì)A549肺癌細(xì)胞的生理活性的影響，為肺癌的治療提供新的思路與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

A549細(xì)胞系購(gòu)自大慶市鴻圖生物科技有限責(zé)任公司（中國(guó)，黑龍江）。

1.1.2 試劑及儀器

DMEM/高糖培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自四季青公司；PBS購(gòu)自HyClone公司；MTT試劑購(gòu)自Amreso公司；DMSO試劑購(gòu)自天津市富宇試劑公司；麗春紅試劑購(gòu)自Solarbio公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；抗mouse anti-Prx V、vimentin、PCNA、P21、抗 rabbit-actin、E-cadherin、Cyclin D1、cleaved-caspase 3的一抗單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；硝酸纖維素膜購(gòu)自BIO-RAD公司；ECL購(gòu)自Thermo Scientific公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿均購(gòu)于NEST公司；蛋白免疫印跡系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Amersham Bioscience公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549肺癌細(xì)胞用DMEM/高糖培養(yǎng)基放置于37℃、5%CO2及濕度適宜的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，DMEM/高糖培養(yǎng)基含有10%滅活的新生胎牛血清（FBS），1%青霉素/鏈霉素（（penicillin/streptomycin，P/S）。

1.3 Prx V基因敲降的A549細(xì)胞的構(gòu)建

對(duì)Prx V的基因序列進(jìn)行查詢，設(shè)計(jì)針對(duì)Prx V基因的 siRNA序列（5′-GGAATCGACGTCTCAAGAGGT-3′）和陰性對(duì)照（negative control）siRNA 序列（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′），送至蘇州吉瑪基因公司進(jìn)行構(gòu)建和包裝，將構(gòu)建的目的慢病毒載體命名為shPrx V和mock。培養(yǎng)A549肺癌細(xì)胞，待細(xì)胞匯合率達(dá)60%左右，加入相應(yīng)病毒懸液，每隔12 h進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)觀察，24 h后停止轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染的病毒將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞分別命名為shPrx V組和mock組。擴(kuò)增兩組細(xì)胞，換用含有2 g·mL-1嘌呤霉素（Puromycin）、20%FBS和1%P/S的DMEM 高糖培養(yǎng)液對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選。培養(yǎng)至相同培養(yǎng)條件下未轉(zhuǎn)染細(xì)胞全部懸浮時(shí)，篩選結(jié)束，檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

1.4 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

將未轉(zhuǎn)染con組A549細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載體mock組A549細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染目的基因shPrx V組A549細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，去掉6孔板培養(yǎng)皿中原有的液體，PBS溶液清洗2遍，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，在熒光顯微鏡下觀察明視野及綠色熒光條件下的視野，拍照成像。每組實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

在96孔板中接種兩組濃度為3×103的A549細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，加入10 L MTT溶液，敲打混勻，培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄去培養(yǎng)液，加入100 L DMSO（二甲基亞砜）敲打混勻，溶解10 min，利用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)定吸光度（OD）的值。連續(xù)檢測(cè)7 d，繪制兩組A549細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。每組實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.6 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將兩組A549細(xì)胞以2×105個(gè)細(xì)胞每孔均勻的接種到24孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每孔用滅菌的白槍頭垂直劃線，PBS洗2～3次。用無(wú)血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，利用熒光顯微鏡分別在0、24 h固定位置拍照。每組實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.7 群落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞群落形成能力

將兩組A549細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞每孔接種到6孔板內(nèi)，培養(yǎng)至肉眼可見密集的細(xì)胞群落后棄去培養(yǎng)液。3.7%多聚甲醛固定10 min，棄去3.7%多聚甲醛，PBS洗一遍，甲醛溶液固定10 min，棄去甲醛溶液，PBS洗一遍，結(jié)晶紫染色40 min，PBS洗兩遍，晾干，掃描成像。每組實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)量

收取成功轉(zhuǎn)染的兩組A549細(xì)胞，PBS洗一遍，8 000 rpm離心3 min，棄凈上清液，冰上操作，加入適量細(xì)胞裂解液，每隔5 min敲打一次，共敲打5次。4℃，12 000 rpm離心30 min，取上清液，通過分光光度計(jì)測(cè)得兩組樣品在595 nm處蛋白質(zhì)濃度。配制為20μg/15μL的蛋白質(zhì)試樣，沸水煮樣5 min，取15μL進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳封閉 1 h，用含有 10 mmol·L-1的 Tris-HCL（TBS）、15 mmol·L-1的NaCl、0.2%Tween-20 的 TBST 洗滌 5 次，5 min·洗一次，抗 mouseanti-Prx V、vimentin、PCNA、P21、抗rabbitactin、E-cadherin、Cyclin D1、cleaved-caspase 3 單克隆一抗，以1∶2 000進(jìn)行稀釋，4℃孵育過夜?；厥找豢梗琓BST洗滌5次，5 min。洗1次，5%脫脂乳封閉10 min，與 HRP 標(biāo)記的鼠或兔二抗（1∶5 000）孵育 1 h，洗膜30 min，5 min更換一次TBST，ECL底物作用。用蛋白質(zhì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行曝光、顯影、定影及結(jié)果分析。每組實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，t檢驗(yàn)檢測(cè)兩組間比較，*P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 Prx V在肺癌中的表達(dá)差異

為了探究Prx V與肺癌存在的關(guān)系，通過http：//gepia.cancer-pku.cn網(wǎng)站對(duì)The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)的肺癌患者腫瘤組織與正常人肺組織中的Prx V表達(dá)量檢索結(jié)果顯示，肺癌患者腫瘤組織中的Prx V表達(dá)量高于正常組織；同時(shí)Prx V高表達(dá)的肺癌患者生存比率明顯低于Prx V低表達(dá)的肺癌患者（圖1A和圖1B），但肺癌發(fā)展不同時(shí)期Prx V表達(dá)含量無(wú)明顯差異（圖1C）。這些結(jié)果表明，在肺癌發(fā)生、診斷以及治療中Prx V可能會(huì)發(fā)揮重要的臨床意義。

2.2 Prx V基因敲降A(chǔ)549細(xì)胞的構(gòu)建及其對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響

為了檢測(cè)Prx V對(duì)A549肺癌細(xì)胞的影響，通過熒光顯微鏡的明視野與綠色熒光視野觀察，結(jié)果顯示細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)染了慢病毒載體（圖2A）。同時(shí)蛋白免疫印跡也進(jìn)一步證明了shPrx V組Prx V蛋白表達(dá)水平明顯下降，并與mock組具有顯著性差異（圖2B和圖2C）。通過MTT法檢測(cè)并繪制兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示shPrx V組細(xì)胞的增殖能力顯著低于mock組（圖2D）。初步研究發(fā)現(xiàn)敲降Prx V顯著降低A549細(xì)胞的增殖能力，因此為了進(jìn)一步檢測(cè)Prx V對(duì)A549細(xì)胞的其他生理活性是否有影響，我們接著進(jìn)行了劃痕和群落形成實(shí)驗(yàn)的研究。

圖1 Prx V在肺癌腫瘤中的表達(dá)和患者預(yù)后存活率的數(shù)據(jù)分析Fig.1 The Prx V expression levels and survival rate analysis in lung cancer patient

圖2 敲降Prx V后對(duì)A549細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of Prx V knockdown on the proliferation of A549 cells

2.3 敲降Prx V對(duì)A549遷移和群落形成能力的影響

為了檢測(cè)敲降Prx V對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響，通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與mock組細(xì)胞相比，shPrx V組細(xì)胞的遷移能力明顯被抑制（圖3A和圖3B）。同時(shí)，群落形成實(shí)驗(yàn)證明，Prx V基因敲降后，A549細(xì)胞的群落形成能力明顯下降（圖3C和圖3D）。為了更進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們利用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深一步的研究。

圖3 敲降Prx V后對(duì)A549細(xì)胞遷移和群落形成能力的影響Fig.3 Effect of Prx V knockdown on the migration ability and plate cloning ability of A549 cells

2.4 敲降Prx V對(duì)A549增殖和遷移相關(guān)蛋白水平的影響

為了明確Prx V對(duì)A549細(xì)胞的調(diào)控作用。通過蛋白免疫印跡法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖、遷移和群落形成相關(guān)蛋白水平的變化。結(jié)果顯示：shPrx V組A549細(xì)胞中的增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)量明顯低于mock組A549細(xì)胞；與mock組相比，波形蛋白Vimentin表達(dá)量下降、E-caderin表達(dá)量升高；細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 P21、Cyclin D1表達(dá)量上升；凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Capase 3表達(dá)量增加（圖4A和圖4B）。以上結(jié)果說明，Prx V基因敲降后A549細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞增殖。敲降Prx V也通過改變遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制A549細(xì)胞遷移。同時(shí)證明了上述MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和群落形成實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

圖4 敲降Prx V后A549細(xì)胞中增殖、遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Expression of markers associated with migration and proliferation in A549 cells after knockdown of Prx V

3 討論

在2018年，大約有170多萬(wàn)名患者死于肺癌[22]，肺癌對(duì)人類幸福生活產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。由于肺癌患病初期無(wú)明顯癥狀，轉(zhuǎn)移到其他部位后，患者感覺不適才會(huì)被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)發(fā)生增殖轉(zhuǎn)移從而擴(kuò)散后，患者存活的時(shí)間僅有幾年或幾個(gè)月。其中非小細(xì)胞肺癌最初對(duì)化療和放療均有耐受性[23]，并且化療和放療都具有強(qiáng)烈的毒性反應(yīng)，導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者的存活時(shí)間被極大縮短，因此找尋抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，減緩肺癌患者病情的發(fā)展，延長(zhǎng)肺癌患者存活時(shí)間的新方案迫在眉睫。

有研究證明，Prx V是一種多功能蛋白，在卵巢癌中Prx V是陰性生存預(yù)測(cè)因子[18]。在CRC結(jié)腸癌細(xì)胞中Prx V可以調(diào)控兩種標(biāo)志性的EMT蛋白Ecadherin和Vimentin的表達(dá)，以及EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達(dá)，顯著促進(jìn)了CRC結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。β-拉帕醌能夠下調(diào)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中Prx V的表達(dá)水平，使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，并通過線粒體依賴性凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。Prx V可能通過上調(diào)Snail的表達(dá)，增強(qiáng)間充質(zhì)表型而導(dǎo)致胃癌預(yù)后不良[15]。以線粒體膜間隙為靶點(diǎn)的Prx V能減弱缺氧誘導(dǎo)的活性氧信號(hào)[19]。SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中MPP+線粒體凋亡通路是由線粒體Prx V調(diào)控的[20]。在肺癌細(xì)胞U1810中，Prx V通過影響線粒體凋亡通路、線粒體跨膜電位、鈣負(fù)荷能力以及線粒體形態(tài)對(duì)抗抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[21]。Prx V參與了促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT和致瘤表型的多功能機(jī)制。此外，Prx V是可能導(dǎo)致預(yù)后不良的重要診斷因素。最后，對(duì)于各種過表達(dá)Prx V的癌癥，Prx V是一個(gè)公認(rèn)的治療靶點(diǎn)和臨床策略[15]。

研究中，利用shPrx V組與mock組A549細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)shPrx V組細(xì)胞增殖、遷移和群落形成能力明顯低于mock組，結(jié)果顯示Prx V對(duì)A549肺癌細(xì)胞的生理活動(dòng)有著顯著的影響。為了進(jìn)行更深一步的研究，經(jīng)查閱論文發(fā)現(xiàn)增殖性細(xì)胞核抗原（PCNA）是DNA復(fù)制過程中的一種輔助蛋白。PCNA與DNA復(fù)制密切相關(guān)，癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，導(dǎo)致患者癌組織內(nèi)的PCNA蛋白水平較正常組織多[24]。E-鈣黏蛋白（E-caderin）的表達(dá)促進(jìn)同種細(xì)胞之間連接和黏附，使癌細(xì)胞不易從原發(fā)灶脫離，能抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。E-caderin表達(dá)量減少時(shí)細(xì)胞遷移和侵襲能力增加[26]。波形蛋白（Vimentin）主要表達(dá)于上皮組織和基底膜組織中，與上皮細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞間緊密連接密切相關(guān)[27]。P21與細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1等密切相關(guān)，能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，當(dāng)P21被激活時(shí)則可促進(jìn)凋亡因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。因此，利用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖、遷移等相關(guān)蛋白水平的變化情況發(fā)現(xiàn)，與mock組相比，shPrx V組A549細(xì)胞中的增殖相關(guān)蛋白PCNA表達(dá)量下降；遷移相關(guān)蛋白Vimentin表達(dá)量下降、E-caderin表達(dá)量升高；細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21、Cyclin D1表達(dá)量升高；細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Capase 3表達(dá)量增加。以上研究結(jié)果表明，敲降Prx V可以有效抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移和群落形成能力，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡。這一研究結(jié)果表明了Prx V對(duì)調(diào)控A549肺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的重要性。但Prx V對(duì)A549細(xì)胞增值、遷移過程中所參與的具體信號(hào)通路并沒有明確的闡明，這將成為我們后續(xù)的研究重點(diǎn)。

綜上所述，敲降Prx V能有效抑制A549細(xì)胞的增殖、遷移以及群落形成能力，同時(shí)引起細(xì)胞周期阻滯，發(fā)生細(xì)胞凋亡。這一研究結(jié)果為臨床抑制肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)患者存活時(shí)間提供了新的治療方案。