姜秀杰 ，張愛(ài)武 ，姜彩霞 ，張桂芳 ，張東杰 ，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

黑豆（Semen glyane）是豆科植物，又稱黑大豆、烏豆，是東北地區(qū)主產(chǎn)作物，其適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，且耐旱、耐鹽堿等特點(diǎn)[1]。黑豆中含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，還有黃酮、皂苷、花青素等活性成分，使黑豆具有多種生理功能，如烏發(fā)明目、補(bǔ)腎養(yǎng)血、祛風(fēng)除熱、抗氧化、降血糖、抗炎和抗癌等作用[2]，現(xiàn)已成為功能食品及藥品開(kāi)發(fā)的重要資源，尤其黑豆色素已成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)，它是一種色澤鮮艷、易溶于水、味道微甜，且有益于人體健康的活性物質(zhì)?；ㄇ嗨刈鳛樯刂饕煞郑瑢儆谏镱慄S酮物質(zhì)，是由黃烷-3-醇和黃烷-3，4-二酚的配位縮合或聚合而成低聚或多聚物[3]，具有雙重抗氧化活性，不僅能產(chǎn)生具有抑制氧化反應(yīng)的代謝物質(zhì)，還能能捕捉自由基的原兒茶酸[4]，可清除體內(nèi)大量自由基；花青素除具有抗氧化性之外，還具有緩解疲勞[4]，神經(jīng)保護(hù)作用[5]、保護(hù)視力[6]、抗高血壓及降糖等生物活性，Bagchi D[7]、周翠[8]、Bridle P[9]、肖珍[10]等研究發(fā)現(xiàn)花青素的抗氧化能力是 VE的50倍，是VC 20倍左右。總之，花青素是一種維持人體健康，預(yù)防相關(guān)疾病的重要活性物質(zhì)，具有抗氧化性強(qiáng)、安全無(wú)毒、易溶解的特點(diǎn)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最好天然抗氧化劑之一，在功能食品及藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

目前，關(guān)于花青素的提取，一般采用溶劑提取法、酶提取法和CO2超臨界萃取法等。溶劑提取法操作簡(jiǎn)單，但存在提取時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗量大，提取率低等缺點(diǎn)[11]，其他酶法和超臨界萃取法等技術(shù)普遍存在耗能成本高等問(wèn)題。超高壓技術(shù)屬于一種非熱加工技術(shù)，2004年首次被用于天然植物有效成分的提取[12]，與傳統(tǒng)提取方法相比，超高壓提取所需時(shí)間最少、作用溫度低、保持了食品原有品質(zhì)和提取率高等優(yōu)勢(shì)，已在天然產(chǎn)物提取方面得到了初步應(yīng)用[13]，但有關(guān)黑豆花青素提取方面的應(yīng)用報(bào)道較少，因此選用超高壓技術(shù)。以黑豆粉為原料，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化黑豆花青素的提取工藝，以期為超高壓技術(shù)在黑豆花青素提取方面的深入研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小黑豆（產(chǎn)自黑龍江省青岡縣，購(gòu)買于大慶市昆購(gòu)超市）；

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：北京索寶萊科技有限公司；上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、香草醛、甲醇、鹽酸等試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

DFY高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（上海左樂(lè)儀器有限公司）；UV721紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；RE-25A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上?？粕齼x器有限公司）；超高壓設(shè)備、超高冷等靜壓機(jī)（上海大隆超高壓設(shè)備有限公司）；FX202-0電熱恒溫干燥箱（鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

顯色劑組成A∶B=1∶1，其中試劑A為甲醇溶液，配制方法為精確稱取1.000 g香草醛于100 mL燒杯中，加適量蒸餾水溶解后，定容于100 mL容量瓶中；試劑B也是甲醇溶液，量取8 mL濃鹽酸稀釋后，定容于100 mL容量瓶中。

參照香草醛－鹽酸法測(cè)定黑豆中原花青素的含量。精確稱取10 mg的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，然后用蒸餾水稀釋，配制成濃度為0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取不同毫升的標(biāo)準(zhǔn)品（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9）放置于 10 mL容量瓶中，添加5 mL AB顯色劑，再用1%鹽酸甲醇溶液定容至刻度線，搖勻后放置在30℃恒溫水浴中水浴30 min，選擇甲醇為空白對(duì)照，在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組分吸光度值，之后以原花青素濃度作為X軸，吸光度作為Y軸，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算分析得到其回歸方程為Y=0.962 X+0.048，R2=0.996 4。

1.3.2 黑豆樣品前處理

黑豆清洗干燥到恒重，然后用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩，真空包裝，放置在-21℃冰箱中保存，減緩黑豆粉末氧化，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 超高壓提取黑豆花青素工藝

稱取前期自制的黑豆粉末1.0 g，放入聚乙烯袋中，加入一定量乙醇（40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇-1%鹽酸溶液），真空包裝封口后進(jìn)行超高壓處理。在常溫條件下，超高壓處理壓力依次為100、200、300、400、500、600 MPa，保壓時(shí)間依次為 2、4、6、8、10、12 min，料液比（g·mL-1）依次為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。按照上述乙醇濃度、處理壓力、保壓時(shí)間、料液比4個(gè)因素設(shè)定的條件對(duì)黑豆粉樣品進(jìn)行處理，對(duì)處理樣液進(jìn)行過(guò)濾后，離心處理10 min（3 000 r·min-1），取其各自上清液，將提取液定容至等體積后，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)530 nm處分別測(cè)定各樣品的吸光度值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，按照Box-Behnken Design中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度（A）、高壓壓力（B）、保壓時(shí)間（C）、料液比（D）四個(gè)因素，以黑豆花青素的提取率為響應(yīng)值，建立四因素三水平的回歸模型，對(duì)超高壓輔助提取黑豆花青素的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1所示。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels table

1.3.5提取率計(jì)算

吸取1.0 mL上述處理得到的黑豆花青素提取液，放置在25 mL容量瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水稀釋值刻度線，在530 nm處測(cè)定其吸光度值，然后根據(jù)前面標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算提取液中花青素的含量[14]。

式中：C代表花青素的濃度（ug/mL）；V代表定容時(shí)消耗的體積（mL）；n代表稀釋倍數(shù)；M為黑豆樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

（1）乙醇濃度對(duì)提取率的影響

花青素類物質(zhì)中存在酸性和堿性基團(tuán)，因此具有溶于水、甲醇、乙醇、稀堿和稀酸等極性溶劑的性質(zhì)，但不溶于有機(jī)溶劑如 乙醚、氯仿等[14]。從食品安全角度出發(fā)，該實(shí)驗(yàn)選擇乙醇作為提取溶劑，并考察了不同乙醇濃度對(duì)超高壓輔助提取花青素效果的影響，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)黑豆花青素提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of anthocyanin from black bean

由圖1可知，隨著乙醇濃度的不斷增加，黑豆花青素的提取率也不斷增大，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取率最大，之后持續(xù)增加乙醇濃度，提取率反而下降。分析其原因，可能是當(dāng)乙醇濃度過(guò)大后，其極性隨之降低，導(dǎo)致花青素類物質(zhì)的溶解性也隨之減弱，同時(shí)還可能產(chǎn)生一些醇溶性雜質(zhì)，進(jìn)而影響了花青素的提取效果，因而選用乙醇濃度范圍在60%～70%之間效果較好。

（2）不同壓力對(duì)黑豆花青素提取效果的影響

常溫狀態(tài)下，乙醇濃度為50%，保壓時(shí)間為4 min，料液比為1∶30的提取條件下，考察不同超高壓壓力對(duì)黑豆花青素提取效果的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖2所示。由圖可知，隨著壓力的升高，提取率不斷增加，當(dāng)壓力達(dá)到400 MPa時(shí)，花青素提取率達(dá)到最大值，之后壓力再升高，提取率反而下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能與超高壓工作原理有關(guān)，當(dāng)壓力達(dá)到一定值時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞器、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜受損，使細(xì)胞滲透能力增加，有利于提取溶劑進(jìn)入到細(xì)胞中，將黑豆中有效成分滲透到細(xì)胞外，進(jìn)而達(dá)到提高黑豆花青素提取率的目的[15]。在一定壓力范圍內(nèi)，壓力與提取率呈現(xiàn)正相關(guān)，即壓力越大提取效果越好，但壓力過(guò)大時(shí)，提取率反而下降，因其高壓可能破壞花青素的結(jié)構(gòu)或者導(dǎo)致其他物質(zhì)生成，進(jìn)而影響花青素的溶出，因此，最適壓力范圍確定為300～500 MPa。

圖2 不同壓力對(duì)黑豆花青素提取率的影響Fig.2 Effect of different pressure on extraction rate of anthocyanin from black bean

（3）保壓時(shí)間對(duì)黑豆花青素提取效果的影響

在超高壓壓力為300 MPa、乙醇濃度為分65%、固液比為1∶30的條件下，考察保壓時(shí)間分別為 2、4、6、8、10和12 min時(shí)，對(duì)黑豆花青素提取效果的影響情況，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，花青素的提取率隨著時(shí)間的增加而增加，當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到6 min后，雖持續(xù)增加保壓時(shí)間，但黑豆花青素的提取率并無(wú)明顯升高。這是由于超高壓可引起溶劑的滲透與溶質(zhì)的溶解快速達(dá)到平衡，使超高壓輔助提取法可在短時(shí)間內(nèi)迅速將目標(biāo)成分提取出來(lái)，并能快速達(dá)到提取終點(diǎn)。這種現(xiàn)象和陳靜雯等[16]報(bào)道的超高壓提取天然產(chǎn)物有效成分的特點(diǎn)相符合。

圖3 保壓時(shí)間對(duì)黑豆花青素提取率的影響Fig.3 Effect of pressure holding time on the extraction rate of black bean anthocyanin

（4）料液比對(duì)黑豆花青素提取效果的影響

在其他提取條件一定下，考察料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60） 對(duì)黑豆花青素提取效果的影響，其結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著料液比從1∶10增加到1∶30，花青素提取率也隨之不斷增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30以后，其提取率達(dá)到最大，且不在隨料液比的增加而增大。這可能是初始的提取溶劑較少，使黑豆物料在溶解過(guò)程中，容易達(dá)到飽和狀態(tài)，減緩花青素的溶出；但隨著提取溶劑的不斷增加，使溶質(zhì)與溶劑達(dá)到飽和狀態(tài)的程度減弱，有利于花青素的溶出，因此，在此階段，提取率有所提高；當(dāng)溶質(zhì)達(dá)到溶解平衡狀態(tài)時(shí)，得率將不再增加，這與馬燕等報(bào)道的超高壓輔助提取辣椒紅色素的研究結(jié)果相似。綜上分析，選擇最適料液比為 1∶30、1∶40 和1∶50作為下一步的工藝優(yōu)化研究的參數(shù)。

圖4 料液比對(duì)黑豆花青素提取率的影響Fig.4 Effect of liquid ratio on the extraction rate of black bean anthocyanin

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 模型建立與顯著性分析

通過(guò)Design-Expert8.0軟件中Box-Behnken模式對(duì)黑豆花青素提取工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)，選取乙醇濃度、料液比、處理壓力、保壓時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以提取率為響應(yīng)指標(biāo)，具體設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 Box-Behnken方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken protocol and results

續(xù)表2 Box-Behnken方案及結(jié)果Continued table 2 Box-Behnken protocol and results

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程：

Y提取率=+3.27+0.090A+0.37B+0.10C+0.20D-0.14A*B+0.47*A*C+0.44*A*D-0.15*B*C-0.24*B*D-0.034*C*D-0.58*A^2-0.41*B^2-0.71*C^2-0.56*D^2

對(duì)建立的回歸模型進(jìn)行顯著性分析，其結(jié)果見(jiàn)表3所示。從表3可以看出，回歸模型的F值=11.78，P＜0.000 1，說(shuō)明模型極顯著，失擬項(xiàng)P值=0.472 9＞0.05，說(shuō)明回歸方程與試驗(yàn)擬合良好，誤差小。回歸方程中一次項(xiàng)A、D為顯著因素，二次項(xiàng)中4 個(gè)因素（A2、B2、C2、D2）均表現(xiàn)出極顯著性，交互項(xiàng)中AC、AD存在顯著性，其余各項(xiàng)對(duì)黑豆花青素提取率影響均不顯著。依據(jù)表中F值的大小，可知考察因素對(duì)黑豆花青素提取率的影響順序依次為B＞D＞C＞A。綜上分析，表明該模型可真實(shí)地反映出考察因素對(duì)提取率影響，可用此模型對(duì)黑豆花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化及預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型分析Table 3 Regression model analysis

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)面圖描述因素與響應(yīng)值之間關(guān)系的三維空間曲面圖，可直觀呈現(xiàn)各因素之間的交互作用對(duì)黑豆花青素提取率的影響程度[17]。圖5、圖6列出的是對(duì)黑豆花青素提取率有顯著交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。圖5顯示的是乙醇濃度A和處理壓力C之間的交互關(guān)系，在其他因素不變的前提下，曲面的陡峭程度越大，等高線的線圈越密集，表明兩個(gè)因素之間的交互作用越強(qiáng)，對(duì)響應(yīng)值影響也越大。由響應(yīng)面圖可知，處理壓力和乙醇濃度的編碼值在[0-1]之間，相應(yīng)值變化幅度較大，且由最高點(diǎn)。

圖6顯示，乙醇濃度A和保壓時(shí)間D之間的交互作用，乙醇濃度和保壓時(shí)間的編碼之在[0-1]之間，隨著乙醇濃度和保壓時(shí)間的增加，黑豆花青素的提取率也增加，但超出此范圍內(nèi)，兩者交互作用減弱，提取率隨著兩者的增加而減小。

圖5 乙醇濃度和處理壓力交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.5 Contour and response surface diagram of the interaction between ethanol concentration and treatment pressure

圖6 乙醇濃度和保壓時(shí)間交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.6 Contour and response surface diagram of the interaction between ethanol concentration and holding time

2.2.3 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert8.0.5.0軟件對(duì)回歸模型預(yù)測(cè)及優(yōu)化分析，得出超高壓輔助提取黑豆花青素的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度 70.10%、料液比 1∶41.40（g∶mL）、處理壓力438 MPa、和保壓時(shí)間6.12 min，在此參數(shù)下，超高壓輔助提取黑豆花青素的提取率預(yù)測(cè)值為3.36 mg·g-1。

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)得到的黑豆花青素含量是一個(gè)理論值，為了驗(yàn)證理論值是否能反映實(shí)際值，開(kāi)展驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。考慮到試驗(yàn)的實(shí)際可操作性，將最佳工藝參數(shù)修正為乙醇濃度 70%、料液比 1∶40（g∶mL）、處理壓力438 MPa和保壓時(shí)間6 min。為保證驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，試驗(yàn)次數(shù)設(shè)定為3次，其提取率平均值為3.47 mg·g-1，與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差值不超過(guò)10%，表明黑豆花青素在優(yōu)化后的得率與最大得率的預(yù)測(cè)值很接近。說(shuō)明模型可靠，回歸方程可以反映各因素對(duì)花青素提取率的影響。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，超高壓輔助提取黑豆花青素的最佳工藝為乙醇濃度 70%、料液比 1∶40（g∶mL）、處理壓力438 MPa和保壓時(shí)間6 min。在此條件下，黑豆花青素的提取率為3.47 mg·g-1。與模型預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差值僅為0.03%，證明該模型是可靠的，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

超高壓提取給原料施加了強(qiáng)大的壓力，促使溶劑快速地滲透到固體原料內(nèi)部，這樣原料中有效成分就會(huì)溶解在溶劑中，具有省時(shí)、綠色、方便、提取效果好等優(yōu)點(diǎn)[18]。據(jù)研究證實(shí)，超高壓雖能破壞分子間氫鍵、離子鍵等非共價(jià)鍵，但對(duì)共價(jià)鍵影響不大。因此，采用超高壓提取活性成分，生物大分子類物質(zhì)受其影響可能會(huì)發(fā)生變性，但小分子物質(zhì)如黃酮、生物堿、色素等受其影響不大[19-20]。說(shuō)明超高壓技術(shù)提取花青素類物質(zhì)不僅提取率高，且能保持花青素的活性成分，為食品中有效成分的提取提供了新技術(shù)、新方法。雖然超高壓提取存在諸多優(yōu)勢(shì)，但應(yīng)用研究仍處于起步階段，未來(lái)需深入研究超高壓技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)變性、分子結(jié)構(gòu)和酶活性等方面的影響，為超高壓技術(shù)的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。