張 昂

(濮陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南濮陽(yáng) 457000)

近年來(lái)，三聚氰胺受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注，尤其是三鹿等品牌的奶制品出現(xiàn)三聚氰胺問(wèn)題，嚴(yán)重打擊消費(fèi)者對(duì)食品安全的信心。三聚氰胺是一種化工原料，對(duì)人體有很大危害。三聚氰胺的含氮量達(dá)到66%。而蛋白質(zhì)的含氮量為16%，一些不法分子通過(guò)添加三聚氰胺造成食品或飼料的蛋白質(zhì)含量虛高。動(dòng)物三聚氰胺慢性毒性試驗(yàn)中，主要癥狀為膀胱癌、腎結(jié)石。三聚氰胺動(dòng)物口服半數(shù)致死量為3100～3300 mg/kg。三聚氰胺主要以同系物或原體形式排出體外，在生物體內(nèi)無(wú)代謝轉(zhuǎn)化。

1 飼料和食品中三聚氰胺毒性

三聚氰胺是重要的尿素后加工產(chǎn)品，別名為蜜胺、三聚酰胺、氰尿酰胺，屬于三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物。三聚氰胺微溶于水及乙醇。在弱酸性條件下，與羥甲基的衍生物反應(yīng)，產(chǎn)生樹脂產(chǎn)物。弱堿性或中性條件下，與甲醛生成羥甲基三聚氰胺。三聚氰胺不溶于四氯化碳、苯、醚，是純白色單斜棱晶體，并且無(wú)味。在飼料和食品中添加少量三聚氰胺，蛋白含量會(huì)出現(xiàn)虛高（李香珍，2020）。因此，一些不法商人會(huì)在食品或飼料中添加三聚氰胺。三聚氰胺主要可以制作三聚氰胺樹脂，用于制作裝飾材料，也可以用于制造化肥、脫漆劑等。

國(guó)際化學(xué)品安全規(guī)劃署在1994年發(fā)布的安全手冊(cè)中說(shuō)明，三聚氰胺長(zhǎng)期或反復(fù)大量攝入可能影響膀胱和腎，產(chǎn)生結(jié)石。在動(dòng)物藥代動(dòng)力實(shí)驗(yàn)中顯示，三聚氰胺基本不能在體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)化，在動(dòng)物腎臟中形成晶體，不通過(guò)肝臟代謝。高濃度三聚氰胺（超過(guò)1.667 mg/mL），增加三聚氰胺濃度，細(xì)胞存活率下降。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，將20000 mg/kg三聚氰胺給小鼠，9 h后小鼠出現(xiàn)不安、呼吸急促反應(yīng)，直到最終小鼠死亡。其他相對(duì)低劑量的小鼠出現(xiàn)厭食、精神不振等，也有的在48 h內(nèi)死亡。解剖小鼠顯示，在輸尿管中存在蓄積大量晶體。部分腎臟被膜中存在晶體。在貓實(shí)驗(yàn)中，添加三聚氰胺作為日糧，晶體出現(xiàn)在貓的腎小管管腔中，并且腎臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血清尿素氮上升（李桂萍，2018）。在生產(chǎn)過(guò)程中同時(shí)存在三聚氰胺、三聚氰酸兩種相似的結(jié)構(gòu)。三聚氰酸可以被反芻類動(dòng)物消化，因此，在反芻動(dòng)物飼料中廣泛應(yīng)用。三聚氰酸加三縮脲應(yīng)用于添加劑，含量不能超過(guò)30%（劉韜等，2017）。三聚氰酸單獨(dú)攝入不會(huì)造成很嚴(yán)重的后果。但如果同時(shí)存在三聚氰胺與三聚氰酸，會(huì)在在腎臟中再次作用，形成大分子不溶于水的復(fù)合物，逐漸沉積，導(dǎo)致結(jié)石（白靜等，2020）。結(jié)石阻塞腎小管無(wú)法排出尿液，嚴(yán)重影響腎臟功能，最終導(dǎo)致腎臟衰竭。目前，對(duì)三聚氰酸、三聚氰胺在血液無(wú)法相互結(jié)合的原因尚不明確，可能是由于腎臟濃縮作用。通常產(chǎn)品含有三聚氰胺，也會(huì)含有三聚氰酸。

2 三聚氰胺殘留的檢測(cè)材料與方法

2.1 材料 原料：南美白對(duì)蝦飼料，羅非魚飼料。

主要試劑：庚烷磺酸鈉，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，Waters Oasis MCX（60 mg）固相萃取柱，檸檬酸，三氯乙酸，乙腈，濃鹽酸，乙酸鉛，二氯甲烷，甲醇，乙酸鉛，氨水等。

主要儀器：光～紫外分光光度計(jì)，電子分析天平，數(shù)控固相萃取儀，超聲波清洗器，超純水機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，氮吹儀，高效液相色譜儀，漩渦混勻器等。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：乙腈為流動(dòng)相。5 μm DIKMA C18（250 mm×4.6 mm）。柱溫40℃。0.45 μm濾膜過(guò)濾試樣液、流動(dòng)相。檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm。離子對(duì)試劑溶液=8∶92（V/V）。進(jìn)樣量20 μL，流速為1.2 mL/min。

2.2.2 樣品前處理 粉碎飼料樣品，取2 g。放入離心管中。在離心管中加入19 mL提取液。然后加入1 mL乙酸鉛溶液，搖勻。超聲處理20 min，離心處理，經(jīng)二氯甲烷萃取。在試管中放入上層液，加入純水2 mL，再次萃取，與水溶液合并，使用3 mL水與甲醇預(yù)先活化。然后Waters Oasis MCX固相萃取柱。保持1 mL/min的速度過(guò)提取液。對(duì)于Waters Oasis MCX固相萃取柱，用淋洗液洗滌，氮吹儀吹干洗脫液，加入1 mL的20%甲醇溶液。使用0.45 μm濾膜過(guò)濾，完成后上機(jī)待測(cè)。

樣品加標(biāo)：l mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液加入樣品。室溫放置0.5 h，取提取液18 mL，然后乙酸鉛溶液1 mL加入其中，其他與樣品處理一致。

2.2.3 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取0.1 g三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品超聲溶解，應(yīng)用甲醇水溶液定容100 mL。

流動(dòng)相：取l L容量瓶，用檸檬酸2.1 g，庚烷磺酸鈉2.02 g，水980 mL溶解。將pH調(diào)節(jié)到2.7，混勻，使用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：使用100 mL容量瓶，放入1 mg/mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容至100 mL，使用甲醇水溶液。作為中間工作液，稀釋為標(biāo)準(zhǔn)工作液10、5、2、1、0.5、0.2 μg/mL。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件選擇試驗(yàn)

3.1.1 流動(dòng)相比例 選擇乙腈與緩沖液的流動(dòng)相比例，10∶90，13∶87，15∶85，20∶80，三聚氰胺峰與雜質(zhì)峰沒(méi)有完全分開，分離度較差，保留時(shí)間太短。流動(dòng)相比例7∶93，8∶92，具有良好的峰形與分離度。但對(duì)于流動(dòng)相比例7∶93，分離出雜質(zhì)，保留時(shí)間太長(zhǎng)。流動(dòng)相比例8∶92與試驗(yàn)要求相符合，因此流動(dòng)相選取乙腈∶緩沖液=8∶92。

表1 三聚氰胺流動(dòng)相pH試驗(yàn)

3.1.2 流動(dòng)相pH 在pH 2.5～4的流動(dòng)相酸度范圍，離子對(duì)的pH越小，保留時(shí)間越短，干擾多，雜峰較多。反之亦然。三聚氰胺色譜的保留時(shí)間受離子對(duì)的影響（高麗婷，2020）。綜合分析，pH=2.7的離子對(duì)最佳，峰形良好，并且三聚氰胺峰、雜質(zhì)峰完全分離。

3.1.3 流動(dòng)相流速 三聚氰胺流動(dòng)相的分離效果受流速的影響。動(dòng)相流速與色譜保留時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，動(dòng)相流速越高，保留時(shí)間越短（孫婭莉，2020）。雜質(zhì)峰與三聚氰胺峰對(duì)流動(dòng)相流速1、1.2 mL/min下均可完全分離，效果相似。本文使用1.2 mL/min的流動(dòng)相流速。

3.2 優(yōu)化樣品前處理方法

3.2.1 洗脫液的回收率 由圖3可知，洗脫液體積不斷增加，回收率先增加到6～7 mL，后開始下降。洗脫體積選取6 mL相對(duì)最干凈，并且回收率最高。

3.2.2 淋洗液選取 選取不同的淋洗液顯示，甲醇和水具有良好的效果，分別3 mL的甲醇和水，回收率92.5%左右，并且相對(duì)穩(wěn)定。分別3 mL的0.1 mol/mL Hcl與甲醇，回收率相對(duì)較低，為86.3%。

3.2.3 不同提取液的效果 選取不同的三聚氰胺提取溶液，如下表所示。每種進(jìn)行三次平行提取，比較提取效果。結(jié)果顯示，50%乙腈水的提取效果比較好，最好的是1 mol/LHCl+50% 乙腈水，提取效果穩(wěn)定，結(jié)果最好。因此，使用乙腈水與HCl為提取溶液。

3.3 線性范圍 選取20 μL進(jìn)樣量分別進(jìn)樣10、5、2、1、0.5、0.2 ug/mL的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，應(yīng)用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系在三聚氰胺濃度為0.2～5 μg/mL時(shí)峰面積良好。

表2 不同提取液提取試驗(yàn)結(jié)果

3.4 回收率及精密度 選取飼料樣品15份，分成3組，每份飼料樣品2 g。分別在每組飼料樣品中加入10、2、1 mg/kg的三聚氰胺，每個(gè)樣品測(cè)5次。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.11%～4.76%，回收率為89%～100%。

3.5 飼料樣品的檢測(cè) 檢測(cè)A飼料公司和B飼料公司的南美白對(duì)蝦飼料、羅非魚飼料，檢測(cè)樣品的三聚氰胺含量如表3。大部分飼料樣品的三聚氰胺含量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但羅非魚飼料超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 飼料樣品中三聚氰胺的檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

本文優(yōu)化高效液相色譜法的色譜條件和處理方法，選取最佳的方式檢測(cè)飼料中的三聚氰胺殘留。在檢測(cè)中使用3 mL甲醇與3 mL水的淋洗液。采用5%氨水甲醇6 mL進(jìn)行洗脫。使用20%甲醇水1 mL溶解。使用50%乙腈水及l(fā) mL lmolHCl作為提取液。15 mL二氯甲烷萃取，然后活化固相萃取柱。色譜條件設(shè)置為240 nm的波長(zhǎng)，1.2 mL/min的流速，柱溫40℃。流動(dòng)相為8∶92的乙腈與緩沖液。檢測(cè)飼料樣品，顯示存在超過(guò)國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)的三聚氰胺含量。