近年來，流行病學(xué)顯示[1]，我國(guó)甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)的發(fā)病率呈逐步增高趨勢(shì)。患者多表現(xiàn)為眼球突出、眼瞼腫脹退縮、上瞼遲滯、結(jié)膜充血水腫、限制性眼外肌病變等癥狀，嚴(yán)重者可致患者失明[2]。根據(jù)患者的病理表現(xiàn)其主要是因眼眶內(nèi)脂肪組織增多和眼外肌肥厚纖維化以及炎性病變而發(fā)病[3]，其中眶內(nèi)脂肪組織增多是誘導(dǎo)TAO發(fā)病的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-likegrowth factor-1,IGF-1)是主要的炎性因子，其表達(dá)水平在診斷TAO病患者中發(fā)揮重要作用[4]，但TAO患者外周血中以及眼眶脂肪組織中IGF-1含量是否增加現(xiàn)無明確定論。同時(shí)研究顯示[5]，TAO患者眼眶脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪生成加速，但很少有對(duì)眼眶脂肪水解方面研究的關(guān)注，而脂肪特異性磷脂酶(adipose-specife phospholipase A,AdPLA)是最重要的脂肪水解調(diào)控因子。故本研究探討了TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA及IGF-1的表達(dá)，以分析AdPLA及IGF-1在TAO發(fā)病機(jī)制中的作用。

資料與方法

一、一般資料

選取我院2016 年8月至2018 年3月收治的50例TAO患者納入研究。入選標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查顯示雙眼多條眼外肌表現(xiàn)為肌腹肥厚[6]；②眼眶CT顯示單側(cè)或雙側(cè)眼球突出，眼眶脂肪增多，眼外肌無肥大或肌腹輕度肥大；③甲狀腺功能障礙或者有甲亢病史；④臨床活動(dòng)性評(píng)分(CAS)<4分；⑤首次發(fā)病，病程≤6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他眼眶疾病者；②凝血功能障礙者；③伴惡性腫瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重臟器功能障礙；④拒絕參與本研究。其中男性20例，女性30例，患者年齡19～69歲，平均(52.26±4.83)歲，病程(0.25±0.06)年。并取同期50例眼部整形手術(shù)者納入對(duì)照組，男性18例，女性32例，年齡18～69歲，平均(51.87±5.62)歲。所有入組對(duì)象均對(duì)研究知情，并且簽署知情同意書。

二、方法

1.主要儀器與試劑：Western Blot電泳儀(Midi-96型)，美國(guó)Thmorgan公司，離心機(jī)(Eppendorf5702型)，德國(guó)Eppendorf公司，RT-PCR儀(C1000 Touch型)，美國(guó)Bio-Rad公司，IFP全自動(dòng)酶標(biāo)儀(TR2100C)，德國(guó)IFP公司。RNA抽提試劑盒(RNAiso Plus，TAKARA，Cat．No．9108)，Perfect Real Time試劑盒(PrimeScriptTM RT Master Mix，TAKARA，Cat．No．RR036A)；兔抗人IGF-1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?；IGF-1 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

2.IGF-1蛋白的檢測(cè)：收集兩組患者眼眶脂肪組織標(biāo)本中，每個(gè)標(biāo)本分成兩部分，一部分經(jīng)10%甲醛固定24 h，石蠟包埋，厚5 μm連續(xù)切片，行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。另一部分標(biāo)本制備切片行常規(guī)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，常規(guī)脫蠟、水化組織切片，pH 6.0的枸櫞酸鈉修復(fù)液95 ℃水浴修復(fù)40 min，阻斷過氧化物酶后PBS沖洗3次，避光孵育15 min，分別于滴加一抗，PBS再?zèng)_洗3次，37 ℃孵育45 min，二抗系統(tǒng)處理經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并封片。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織中IGF-1蛋白的表達(dá)，以細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕褐色染色為陽(yáng)性反應(yīng)，計(jì)數(shù)5個(gè)視野中細(xì)胞著色程度及著色細(xì)胞比例。參考文獻(xiàn)確定陽(yáng)性反應(yīng)，并記錄2個(gè)組中強(qiáng)陽(yáng)性例數(shù)。

三、AdPLA mRNA表達(dá)

(1)RNA提?。河肦NA抽提試劑盒進(jìn)行RNA提取，操作按照說明書進(jìn)行；(2)反轉(zhuǎn)錄：將1 μg抽提的RNA用Perfect Real Time試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將提取的RNA用DEPC水吹起(共8 μl)，加入2 μl 5×PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物，置于37 ℃水浴15 min，85 ℃水浴5 s，然后快速冰浴。(3)PCR：以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)來定量檢測(cè)AdPLA mRNA的表達(dá)水平。通過細(xì)胞內(nèi)參照基因(GAPDH)取得常態(tài)目標(biāo)值，以確定mRNA的表達(dá)水平。AdPLA及GAPDH引物見表1。

表1 AdPLA及GAPDH引物序列

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者眼球突出度及眼眶脂肪量比較

TAO組患者眼球突出度、眼眶脂肪量均明顯多于對(duì)照組(P<0.01)。見表2。

表2 兩組患者眼球突出度及眼眶脂肪量比較

二、兩組患者眼眶脂肪組織中IGF-1表達(dá)

TAO組IGF-l主要在脂肪細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕褐色表達(dá)；對(duì)照組呈淡棕色染色。TAO組眼眶脂肪細(xì)胞中IGF-1的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 兩組患者眼眶脂肪組織中IGF-1表達(dá)

三、兩組患者眼眶脂肪組織中AdPLa基因的表達(dá)

TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者眼眶脂肪組織中AdPLA基因的表達(dá)

討 論

一、TAO的組織病理學(xué)特點(diǎn)

TAO屬于自身免疫性的眼病，表現(xiàn)為眼眶炎性改變，誘發(fā)患者雙眼或單眼突出，其主要病理過程為眼眶脂肪增生、炎性反應(yīng)以及糖胺聚糖(GAG)沉積[7，8]。研究顯示[9]，眼眶成纖維細(xì)胞在多因素刺激下被自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞識(shí)別，引起自身免疫反應(yīng)。導(dǎo)致大量炎性因子在眼眶組織中聚集，促使眼眶成纖維細(xì)胞增生并分泌大量GAG并結(jié)合大量水分，從而誘發(fā)眼眶脂肪組織和眼外肌間質(zhì)水腫[10]；同時(shí)眼眶成纖維細(xì)胞增生分化為脂肪細(xì)胞，進(jìn)而形成TAO的特異性表現(xiàn)[11]。本研究結(jié)果顯示，TAO組患者眼球突出度、眼眶脂肪量均明顯多于對(duì)照組(P<0.01)。與上述報(bào)道結(jié)果相似。

二、IGF-1在TAO形成中的作用

IGF-1是多種疾病的炎性標(biāo)志因子，呈現(xiàn)高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，TAO組眼眶脂肪細(xì)胞中IGF-1的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于標(biāo)本對(duì)照組(P<0.05)。這與王鈺嬌等[12]研究結(jié)果一致。可能的原因?yàn)椋篒GF-1可特異性地與IGF-1R結(jié)合并活化P13K信號(hào)通路，上調(diào)過氧化物酶體增生物激活受體y(PPAR7)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞趨化因子白細(xì)胞介素-16和受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)的表達(dá)，引發(fā)全身免疫反應(yīng)[13-15]，大量炎性因子知道為什么，量增生，釋放大量炎性介質(zhì)，眼眶成纖維細(xì)胞被激活，促進(jìn)脂肪生成及分泌大量GAG[5]，從而誘發(fā)TAO。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，TAO組患者脂肪細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中可見IGF-1棕褐色染色，而對(duì)照組呈現(xiàn)淡棕色染色，表明IGF-1在TAO患者眼眶脂肪組織呈現(xiàn)高表達(dá)，可能參與了脂肪細(xì)胞增生及成熟的整個(gè)過程。

三、AsPLA在TAO形成中的作用

眼眶脂肪組織增生是TAO患者的最主要病理過程，主要表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞數(shù)量的增多和脂肪細(xì)胞體積的增大。大量研究顯示，TAO患者眼眶脂肪細(xì)胞的生成加快，如通過抑郁脂肪生成來改善疾病只能抑制新的脂肪細(xì)胞的增加，對(duì)于已經(jīng)生成的眼眶脂肪組織則無作用，易導(dǎo)致已生成的組織過多堆積。而筆者經(jīng)過多年的臨床經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除了抑制新生的脂肪組織外，加速眼眶脂肪水解則可有效解決已存在的脂肪組織的堆積，使脂肪細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯水解成游離脂肪酸(FFA)和甘油，釋放循環(huán)中，從而更有利于改善眼球突出。脂肪水解的過程受很多內(nèi)分泌因子和激素的調(diào)控[16]，AdPLA是其中最重要的自分泌和旁分泌的脂肪水解調(diào)控因子，它水解磷脂的sn-2位產(chǎn)生花生四烯酸(AA)和FFA，AA通過環(huán)氧合酶(cox)產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)，后者與脂肪細(xì)胞表面的Gai偶聯(lián)的前列腺素受體3(EP3)相結(jié)合，抑制腺苷酸環(huán)化酶而抑制脂肪水解。研究表明[17]，AdPLA-缺陷小鼠出現(xiàn)了無限制性的全身脂肪水解。

本研究證實(shí)，TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA mRNA的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。我們推測(cè)，AdPLA的高表達(dá)使得TAO眼眶脂肪水解減少，從而加重了眼眶脂肪的堆積和眼球突出。所以，利用脂肪水解原理，采用RNA干擾技術(shù)沉默眼眶脂肪AdPLA基因來促進(jìn)眼眶脂肪水解，可能為TAO患者提供一條非手術(shù)的治療方法。 綜上所述，TAO患者眼眶脂肪組織中AdPLA基因及IGF-1表達(dá)均增加，二者可作為早期診斷TAO的指標(biāo)，但具體是什么原因?qū)е翧dPLA基因及IGF-1表達(dá)升高，尚需進(jìn)一步研究。