饒秋華，劉 洋，張志燈，羅 欽，何肖云，羅土炎*

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003；2. 福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350003）

假單胞菌屬（Pseudomonas）廣泛分布于土壤、淡水、海水以及生物體中，是一類生長(zhǎng)適應(yīng)能力較強(qiáng)的革蘭氏陰性菌[1]，目前該屬包含216 個(gè)已有效發(fā)布且名稱正確的種（https://lpsn.dsmz.de/genus/pseudomonas）。假單胞菌屬內(nèi)部分菌株不僅是魚(yú)、蝦和甲殼類的病原菌，而且還極易引起人的急性腹瀉和敗血癥，因此也是人魚(yú)共患的病原菌[2]。常見(jiàn)的水產(chǎn)病害假單胞菌主要以銅綠假單胞菌[3]、惡臭假單胞菌[4]、熒光假單胞菌[5]、鰻敗血假單胞菌和殺香魚(yú)假單胞菌[6]等為主。

澳洲墨瑞鱈（Murray cod，Maccullochella peelii peelii）是國(guó)內(nèi)近年興起的養(yǎng)殖品種，原產(chǎn)于澳大利亞墨瑞河流域[7-8]，因其特殊的外形，鮮美的口感以及豐富的營(yíng)養(yǎng)而備受廣大消費(fèi)者青睞[9]。但隨著養(yǎng)殖集約化程度不斷提高，養(yǎng)殖過(guò)程中澳洲墨瑞鱈的病毒病、寄生蟲(chóng)病及細(xì)菌病不斷出現(xiàn)，而細(xì)菌則是其中分布范圍最廣泛、危害較嚴(yán)重的病原[10]。2018年3 月浙江省樂(lè)清市某養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)，澳洲墨瑞鱈出現(xiàn)頭部皮膚褪色、潰爛，部分養(yǎng)殖池出現(xiàn)大量死亡，死亡率達(dá)60%。解剖發(fā)現(xiàn)，病魚(yú)鰓部充血，部分魚(yú)有腹水，部分內(nèi)臟有充血病變癥狀。本實(shí)驗(yàn)室前期在患病澳洲墨瑞鱈頭部潰瘍處分離了一株魚(yú)假單胞菌（Pseudomonas piscis）MC042[11]，本研究進(jìn)一步分析菌株MC042 的基因進(jìn)化地位，同時(shí)進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)及其對(duì)30 種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，旨在為由該菌引起澳洲墨瑞鱈細(xì)菌性疾病的有效防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料魚(yú)假單胞菌MC042 為本實(shí)驗(yàn)室前期分離[11]。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR相關(guān)試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；試驗(yàn)中所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 16S rRNA 基因擴(kuò)增和看家基因串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建利用細(xì)菌基因組DNA 試劑盒提取MC042 菌株基因組DNA，使用通用引物27F/1492R 擴(kuò)增菌株MC042 的16S rRNA 基因序列。將PCR 產(chǎn)物克隆至pMD19-T 載體（TaKaRa）測(cè)序。通過(guò)BLASTN（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和EzTaxon-e 服務(wù)器（http://www.ezbiocloud）對(duì)16S rRNA 基因序列進(jìn)行序列比對(duì)[12]。從菌株MC042 基因組序列中提取看家基因gyrB，rpoD 和rpoB 基因序列，采用鄰接法和最大似然法構(gòu)建基于4 種看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoD 和rpoB）串聯(lián)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[11]。

1.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)及致病性檢測(cè)無(wú)菌條件下，將菌株MC042 劃線接種至TSA 固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)16 h，用無(wú)菌PBS 洗下菌落，3500 r/min 離心20 min 收集菌體，所得菌體用無(wú)菌PBS 離心洗滌3 次，按照麥?zhǔn)媳葷岱z測(cè)菌液濃度后，將菌液配置成1×109cfu/mL（A 組），10 倍倍比稀釋得到1×108cfu/mL（B 組）、1×107cfu/mL（C 組）、1×106cfu/mL（D 組）、1×105cfu/mL（E 組）濃度。將健康澳洲墨瑞鱈在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)10 d 后隨機(jī)分成6 組，每組30 尾，采用腹鰭基部注射法，分別注射0.5 mL 不同濃度的菌液，對(duì)照組注射0.5 mL 滅菌PBS（F 組），每組設(shè)置3 個(gè)平行組。連續(xù)觀察7 d，記錄死亡情況，計(jì)算7 d 總平均死亡率，數(shù)據(jù)保留小數(shù)點(diǎn)后一位。利用IBM SPSS statistics 22.0 軟件計(jì)算菌株MC042 對(duì)健康澳洲墨瑞鱈的半數(shù)致死濃度（LD50）。同時(shí)取回歸感染瀕死澳洲墨瑞鱈潰瘍組織和內(nèi)臟組織進(jìn)行細(xì)菌的再分離培養(yǎng)與鑒定，以確定致病菌。

1.4 抗生素敏感試驗(yàn)將菌株MC042接種于TSB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)24 h 后，按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌懸液濃度為1.0×108cfu/mL，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)均勻涂布于TSA 固體培養(yǎng)基上，待菌液吸收后，用滅菌的鑷子將30 種藥敏紙片均勻置于培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿貼4 片，每種藥物設(shè)3 個(gè)重復(fù)。28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取抑菌環(huán)直徑平均值，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所出版的藥敏試驗(yàn)指南[13]的標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對(duì)不同藥物的敏感性。質(zhì)控菌株為大腸桿菌（ATCC25922）。

2 結(jié)果與討論

2.1 16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果與序列分析獲得的菌株MC042 的16S rRNA 基因序列在GenBank的登錄號(hào)為L(zhǎng)C500601。將該序列提交到EzBio Cloud（https://www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），16S rRNA 基因序列與Pseudomonas juntendi BML3T相似度最高，為98.9%?？醇一颍?6S rRNA，gyrB，rpoD 和rpoB 基因序列）串聯(lián)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)是假單胞菌分類的重要依據(jù)[14]，基于看家基因串聯(lián)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示菌株MC042 隸屬于假單胞菌屬，與屬內(nèi)的其它菌株具有相對(duì)獨(dú)立的進(jìn)化地位，與模式菌株P(guān)seudomonas protegens CHA0T和Pseudomonas saponiphila DSM 9751T聚集到一個(gè)進(jìn)化分支（圖1），表明其可能與這兩個(gè)菌株具有相似的生理生化特性。

圖1 分離菌基于看家基因（16S rRNA，gyrB，rpoD 和rpoB）串聯(lián)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（鄰近法）Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on housekeeping genes(16SrRNA gene sequence,gyrB,rpoD and rpoB)of strain MC042.Bar,0.05 Knuc

2.2 回歸感染及致病性試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組澳洲墨瑞鱈在腹鰭基部接種感染初期，表現(xiàn)為食欲廢絕，無(wú)力游動(dòng)，腹部貼于池底；解剖患病或?yàn)l死病魚(yú)顯示腮部充血、部分內(nèi)臟有充血病變癥狀，與自然發(fā)病澳洲墨瑞鱈病變相似（圖2）。同時(shí)，從感染瀕死魚(yú)體的潰瘍等組織處再次分離到魚(yú)假單胞菌，其形態(tài)、生理生化特征與菌株MC042 一致，表明該菌株是澳洲墨瑞鱈患病的病原菌。

利用不同濃度的細(xì)菌對(duì)健康的澳洲墨瑞鱈進(jìn)行回歸感染后連續(xù)觀察7 d，發(fā)現(xiàn)健康澳洲墨瑞鱈在回歸感染2 d 后，A 組全部死亡，總平均死亡率為100%，4 d 以后B 組、C 組、D 組不再出現(xiàn)死亡，總平均死亡率分別為83.3%、66.7%、32.0%，E 組與對(duì)照組未見(jiàn)死亡。經(jīng)計(jì)算，菌株MC042 對(duì)澳洲墨瑞鱈LD50為4.82×106cfu/mL。

澳洲墨瑞鱈作為新興產(chǎn)業(yè)剛剛起步，關(guān)于假單胞菌對(duì)其致病性的報(bào)道尚較少，本研究通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室前期分離的魚(yú)假單胞菌MC042 株進(jìn)一步的研究，首次證實(shí)該菌對(duì)澳洲墨瑞鱈具有一定的致病性。

圖2 自然發(fā)病澳洲墨瑞鱈癥狀Fig.2 Symptoms of Murray cod with natural onset

2.3 分離菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果質(zhì)控菌株ATCC25922的抑菌圈大小在允許范圍內(nèi)，藥敏結(jié)果顯示，菌株MC042 對(duì)頭孢他啶、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那、哌拉西林、多粘菌素等11種藥物敏感；對(duì)多西環(huán)素和頭孢曲松2種藥物中度敏感；對(duì)四環(huán)素、克林霉素、氯霉素、紅霉素、頭孢拉定、氨芐西林、苯唑西林、呋喃唑酮等17種藥物耐藥（表1）。由此可見(jiàn)，菌株MC042對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素中的青霉素類和頭孢類多種藥物產(chǎn)生耐藥性，表現(xiàn)出多重耐藥性。假單胞菌能通過(guò)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶、改變細(xì)菌外膜的滲透性和各種主動(dòng)泵系統(tǒng)以及形成生物膜而對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性。

表1 魚(yú)假單胞菌MC042 株藥物敏感結(jié)果Table 1 Antibiotics susceptibility of Pseudomonas piscis MC042

濫用抗生素的問(wèn)題在水產(chǎn)養(yǎng)殖中普遍存在，常導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的出現(xiàn)，同時(shí)抗生素殘留對(duì)人類健康也存在威脅。菌株MC042 的多重耐藥性可能與該養(yǎng)殖廠的用藥習(xí)慣或其自身攜帶的耐藥基因有關(guān)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果建議生產(chǎn)實(shí)踐中可優(yōu)先選擇氨基糖苷類和喹諾酮類等抗菌藥物治療由魚(yú)假單胞菌引起的魚(yú)類疾病。因此，在對(duì)水產(chǎn)病原菌進(jìn)行研究時(shí)，要著重分析菌株藥敏特性，用以指導(dǎo)用藥，避免藥物的濫用。

本研究通過(guò)進(jìn)一步對(duì)魚(yú)假單胞菌MC042 株的基因進(jìn)化分析，致病性和耐藥性研究，為澳洲墨瑞鱈源魚(yú)假單胞菌疾病的防治和澳洲墨瑞鱈高密度循環(huán)水健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。