王文佳，鄧廷賢，徐照學(xué)，張 彬，孟紅麗，王亞州，蘭亞莉*，師志海*

（1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水牛研究所，廣西 南寧 530001）

星狀病毒（Astrovirus，AstV）是單股正鏈無囊膜的RNA 病毒，有2 個(gè)病毒屬：哺乳動(dòng)物星狀病毒屬（Mamastrovirus）和禽星狀病毒屬（Avastrovirus），分別感染哺乳動(dòng)物和禽類[1]。1978 年，在英國(guó)急性腹瀉的犢牛糞便中首次發(fā)現(xiàn)牛星狀病毒（Bovine astrovirus，BAstV）[2]，隨后，蘇格蘭[3]、日本[4]、加拿大[5]等也相繼報(bào)道了BAstV。BAstV 感染會(huì)引起犢牛腹瀉，且常與其它腹瀉病原，如牛輪狀病毒（Bovine rotavirus， BRoV）， 牛 環(huán) 曲 病 毒（Bovine torovirus，BToV），尤其是牛諾如病毒（Bovine norovirus，BNoV）等共感染，增加疾病的嚴(yán)重性。近年來BAstV 感染可引起牛發(fā)生腦炎，出現(xiàn)神經(jīng)性疾病[6]，因此BAstV感染越來越受到重視。

BNoV 是杯狀病毒科、諾如病毒屬的單股正鏈RNA 病毒，是引起新生犢牛腹瀉的主要病毒性病原之一[7]。1978 年，BNoV 在英國(guó)急性腹瀉犢牛的糞便中首次被發(fā)現(xiàn)[2]，我國(guó)于2017 年首次在腹瀉犢牛糞便中檢測(cè)出該病毒[8]。諾如病毒有6 個(gè)基因群[9]，BNoV 屬于GIII 群，其中BNoV 又細(xì)分為2 個(gè)基因型，分別是以Bo/Jena/80/DE 株為代表的基因1 型和以Bo/Newbury2/76/UK 株為代表的基因2 型[10]，目前我國(guó)普遍流行的是基因1 型BNoV。BNoV 感染犢牛后常引起腹瀉、厭食和消化不良，3 周齡犢牛比新生犢牛癥狀嚴(yán)重。我國(guó)對(duì)BAstV 和BNoV 的相關(guān)報(bào)道較少，另外二者在犢牛腹瀉中的作用還存在爭(zhēng)議，有待于更多的研究求證。因此，本研究建立了同時(shí)檢測(cè)BAstV 和BNoV 的雙重PCR 方法，并檢測(cè)了采集自河南省規(guī)?；?chǎng)的腹瀉糞便樣品，為BAstV和BNoV 的早期臨床檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料BNoV、BAstV、BToV、BRoV、牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCoV）、牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛嵴病毒（BovineKobuvirus，BKoV）cDNA 均由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存；221 份糞便樣品采集自2017 年9 月～2019年5 月采集自河南省規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)出現(xiàn)腹瀉癥狀的犢牛，犢牛月齡均為3 月齡以下；全部樣品單獨(dú)分裝，詳細(xì)記錄牛的品種、年齡、采樣日期、樣品數(shù)量等信息，用冰袋帶回實(shí)驗(yàn)室立即檢測(cè)，或置-80 ℃保存。

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、Prime-ScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit、克隆載體pMD18-T、大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞、2×Premix Taq、DL2000 DNA Marker 等購(gòu)自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank 登錄的BAstV ORF1a 基因（KJ620980）和BNoV RdRp 基因（NC029645）的保守序列，利用oligo6.0 軟件分別設(shè)計(jì)2 對(duì)引物，預(yù)期擴(kuò)增BAstV 片段大小為376 bp，上游引物AF1：GCACGTTCGTCCTCGATGT/下游引物AR1：ATACGT TTGGCCTCGCTCACA；擴(kuò)增BNoV 片段大小為542 bp，上游引物NF1：GGCAAACCACGCAAACAAC/下游引物NR1：CTTCCGAAAGGGCACAGA。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 單一PCR 的擴(kuò)增以BAstV 和BNoV 的cDNA為模板，分別進(jìn)行各自單一PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：模板cDNA 2 μL，2×Premix Taq 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 補(bǔ)足20 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃5 min；94 ℃40 s、52 ℃40 s、72 ℃40 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定利用膠回收試劑盒分別回收1.3 中擴(kuò)增的目的條帶，克隆于pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-BAstV 和pMD-BNoV，分別轉(zhuǎn)化至E. coli JM109 感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性克隆菌由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的樣品擴(kuò)大培養(yǎng)后采用質(zhì)粒提取試劑盒分別提取pMD-BAstV 和pMD-BNoV，用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度并換算為換貝數(shù)，分別作為雙重PCR 反應(yīng)的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 雙重PCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化以pMDBAstV 和pMD-BNoV 的混合質(zhì)粒為模板，采用方陣法分別對(duì)退火溫度（50 ℃～55 ℃）、循環(huán)次數(shù)（25 次～35 次）、引物用量（0.2 μL～1 μL）、模板量（0.5 μL～4 μL）等進(jìn)行優(yōu)化，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 特異性試驗(yàn)以BRoV、BToV、BCoV、BVDV、BKoV 的cDNA 為模板，分別以重組質(zhì)粒pMD-BAstV、pMD-BNoV 以及二者的混合物為陽性對(duì)照，以ddH2O 為陰性對(duì)照，利用本研究建立的雙重PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)采用ddH2O 對(duì)pMD-BAstV、pMDBNoV 進(jìn)行10 倍倍比稀釋，利用已優(yōu)化的雙重PCR方法和單一PCR 方法分別進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)ddH2O 為陰性對(duì)照，以確定該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)利用所建立的雙重PCR 方法分別進(jìn)行批內(nèi)和批間試驗(yàn)。批內(nèi)試驗(yàn)：以拷貝數(shù)分別為1.09×106拷貝/μL 的pMD-BAstV 和1.42×106拷貝/μL的pMD-BNoV 為模板，一次試驗(yàn)做4 個(gè)重復(fù)；批間試驗(yàn)：不同時(shí)間段分別從陽性克隆菌JM109 中提取pMD-BAstV、pMD-BNoV 兩種重組質(zhì)粒，同一實(shí)驗(yàn)條件下分別進(jìn)行4 次試驗(yàn)。以此確定檢測(cè)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)用PBS 按1∶10（w∶v）分別混懸221 份糞便樣品，漩渦震蕩，4 ℃8000 r/min 離心5 min，收獲上清，利用MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit 提取病毒RNA，利用PrimeScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，利用本研究建立的雙重PCR 方法和單一PCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的符合率，同時(shí)調(diào)查河南省腹瀉犢牛BAstV 和BNoV 的感染情況。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定結(jié)果經(jīng)測(cè)序鑒定正確的pMD-BAstV 和pMD-BNoV 重組質(zhì)粒采用超微量核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度分別為36.5 ng/mL 和50.3 ng/mL，經(jīng)計(jì)算分別為1.09×1010拷貝/μL、1.42×1010拷貝/μL。

2.2 雙重PCR 方法的構(gòu)建及優(yōu)化優(yōu)化后的反應(yīng)體系為20 μL：包括2×Premix Taq 10 μL，AF1、NF1 各0.5 μL（10 μmol/L），AR1、NR1 各0.5 μL（10 μmol/L），模板2 μL，ddH2O 補(bǔ)足20 μL；最佳反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃40 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。以pMD-BAstV 和pMD-BNoV 的混合重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、pMD-BAstV、pMD-BNoV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，利用優(yōu)化后的雙重PCR 反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，以ddH2O 為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，該方法可同時(shí)擴(kuò)增出了約400 bp 和550 bp 的目的條帶（圖1），擴(kuò)增的目的片段均經(jīng)測(cè)序鑒定正確。表明本研究設(shè)計(jì)的引物能特異性地?cái)U(kuò)增出目的片段。

圖1 雙重PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of the duplex PCR

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果利用已建立的雙重PCR 反應(yīng)方法對(duì)BRoV、BToV、BCoV、BVDV、BKoV 的cDNA 和重組質(zhì)粒pMD-BAstV、pMD-BNoV 進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示除重組質(zhì)粒pMD-BAstV、pMD-BNoV 擴(kuò)增出大小相符的目的片段外，其余病原均不能擴(kuò)增出目的片段（圖2），表明本研究建立的雙重PCR 方法特異性強(qiáng)。

圖2 雙重PCR 方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity assay of the duplex PCR

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果ddH2O pMD-BAstV 和pMDBNoV 重組質(zhì)粒經(jīng)10 倍倍比稀釋（pMD-BAstV：1.09×107拷貝/μL～10.9 拷貝/μL；pMD-BNoV：1.42×107拷貝/μL～14.2 拷貝/μL）后作為模板，進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該方法對(duì)BAstV 和BNoV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限分別為1.09×103拷貝/μL 和1.42×103拷貝/μL（圖3），與單一PCR 方法對(duì)這兩種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)下限一致。表明本研究建立的雙重PCR 方法敏感性高。

圖3 雙重PCR 方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Sensitivityassay of the duplex PCR

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)試驗(yàn)與批間試驗(yàn)結(jié)果均顯示利用雙重PCR 方法擴(kuò)增出的條帶亮度基本一致（圖4），表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品檢測(cè)利用本實(shí)驗(yàn)建立的雙重PCR 方法與單一PCR 方法分別對(duì)221 份犢牛腹瀉糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，BAstV 單一檢出率為18.1%，BNoV 單一檢出率為9.96%，BAstV 和BNoV 共感染的檢出率為1.36%，表明河南省腹瀉犢牛存在BAstV和BNoV 感染，且存在該兩種病毒共同感染。將雙重PCR 與單一PCR 對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，二者符合率為100%（表1）；表明本研究所建立的雙重PCR 方法可用于BAstV 和BNoV 感染的臨床檢測(cè)及疾病的流行病學(xué)調(diào)查。

圖4 雙重PCR 的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Repeatability assay of the duplex PCR

表1 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection of clinical samples

3 討 論

隨著規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，動(dòng)物疫病流行方式也在發(fā)生變化，尤其是病原的混合感染愈發(fā)嚴(yán)重。近年來隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的迅猛發(fā)展，犢牛腹瀉和牛呼吸道疾病綜合征等病癥也成為困擾養(yǎng)牛業(yè)的難題，這可能與病原的種類增加、新發(fā)病原感染率高、混合感染嚴(yán)重等因素有關(guān)。

犢牛腹瀉是犢牛尤其是30 日齡以下犢牛最為嚴(yán)重的常見疾病，會(huì)引起犢牛死亡，犢牛生長(zhǎng)發(fā)育延緩，母牛初產(chǎn)年齡增大，疾病治療和護(hù)理成本增加，給牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。2007 年美國(guó)動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)系統(tǒng)指出57%的斷奶前犢牛死亡都是由犢牛腹瀉引起，如韓國(guó)[11]和伊朗[12]。星狀病毒和諾如病毒是引起食源性疾病的主要病原。BNoV 感染犢牛后，可引起犢牛急性、間歇性、持續(xù)性腹瀉[13]，嚴(yán)重者伴有腸上皮壞死和腸絨毛萎縮[14]，并可長(zhǎng)期通過糞便排毒。BAstV 感染犢牛后，通常不會(huì)引起犢牛發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，但高達(dá)60%～100%的犢牛常呈隱性感染且可長(zhǎng)期帶毒[15]。近年來星狀病毒被發(fā)現(xiàn)與人類腦炎有關(guān)，BAstV 感染引起牛發(fā)生腦炎的病例也相繼被報(bào)道[6,16]，且存在星狀病毒跨物種傳播的可能[17]，應(yīng)該引起人們重視。

作為最具代表性的現(xiàn)代檢測(cè)和診斷新技術(shù)，PCR 技術(shù)一直被廣泛應(yīng)用，并衍生出多重PCR 等技術(shù)。多重PCR 技術(shù)與單一PCR 技術(shù)相比，不僅極大地縮短了臨床混合感染病例的鑒別和診斷時(shí)間，還省時(shí)、省力、經(jīng)濟(jì)，對(duì)臨床檢測(cè)和診斷具有極高實(shí)用價(jià)值[18]。而BAstV 和BNoV 均屬于RNA 病毒，這為建立雙重PCR 方法提供了便利。目前關(guān)于BNoV 的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道，而能夠同時(shí)檢測(cè)BAstV 和BNoV的方法國(guó)內(nèi)尚無相關(guān)報(bào)道。本研究分別以BAstV ORF1a 基因和BNoV RdRp 基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，并通過對(duì)PCR 擴(kuò)增體系和條件的優(yōu)化，在國(guó)內(nèi)首次建立了針對(duì)該兩種病毒的雙重PCR方法。試驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有較強(qiáng)的特異性、高敏感性和良好的重復(fù)性，臨床應(yīng)用也表明該方法同樣適用于大規(guī)模的病毒檢測(cè)。其中對(duì)河南省規(guī)模化牛場(chǎng)的腹瀉糞便樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，BAstV 和BNoV在河南省的牛場(chǎng)中已經(jīng)存在，且存在同一犢牛共同感染BAstV 和BNoV 的情況。

本研究建立的BAstV 和BNoV 的雙重PCR 檢測(cè)方法，為這兩種病毒感染早期的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持，對(duì)這兩種病毒混合感染及生物學(xué)關(guān)系的進(jìn)一步研究具有重要意義。