楊 霞，蒲翠敏，胡安東，張 飄，楊 穎，程振濤，文 明

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/貴州大學(xué)動物疫病研究所/貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025）

鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）又稱鴨瘟病毒（Duck plague virus，DPV），屬皰疹病毒科皰疹病毒亞科成員，可引起鴨、鵝及多種雁行目禽類發(fā)生一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，其病變特征為血管損傷、消化道黏膜出血壞死、淋巴器官和實質(zhì)性臟器退行性病變，是目前嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要病原之一[1]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對DEV 開展多方面深入研究，取得了諸多進展，但有關(guān)DEV 感染對宿主腸道菌群多樣性影響研究鮮有報道。

動物腸道菌群在正常情況下處于動態(tài)平衡，對維持動物機體健康具有重要作用[2]。當(dāng)動物機體受到病原微生物侵害時，引起動物免疫系統(tǒng)功能以及其它生理功能下降或紊亂，影響腸道內(nèi)菌群平衡狀態(tài)，導(dǎo)致病情進一步加重。DEV 感染的主要病變是腸道黏膜出血壞死，這勢必造成鴨腸道菌群平衡紊亂。因此，本研究采用Illumina 高通量測序技術(shù)，開展DEV 感染對鴨腸道菌群多樣性的影響研究，探索DEV 感染后鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，為DEV 感染的微生態(tài)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與實驗動物DEV-GZ 株[3]，由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室提供，TCID50=3.16×10-9/0.1 mL。1 日齡三穗麻鴨60 只，購自貴州省貴陽綠源禽業(yè)有限公司，經(jīng)血清學(xué)和病原學(xué)檢測均為DEV陰性。將1 日齡三穗麻鴨轉(zhuǎn)入貴州大學(xué)動物疫病研究所動物飼養(yǎng)房，按常規(guī)方法飼養(yǎng)至35日齡。

1.2 主要試劑HiPure Stool DNA Kits 購自QIAGEN公司；ABI Step One Plus Real-Time PCR System 購自Life Technologies 公 司；AMPure XP Beads 購 自Beckman Coulter 公司；無水乙醇購自廣州化學(xué)試劑公司；瓊脂糖（Agarose）購自Invitrogen 公司。

1.3 人工感染及樣品采集取35 日齡健康三穗麻鴨，隨機分成2 組，即感染組和對照組，每組30只。感染組鴨腿部肌肉注射DEV病毒液0.1 mL，對照組鴨腿部肌注滅菌生理鹽水0.1 mL，于注射后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 時分別迫殺各組實驗鴨，每次5 只，迅速采集腸內(nèi)容物，由廣州基迪奧生物科技有限公司進行鴨腸道菌群高通量測序。

1.4 基于16S rRNA 基因高通量測序取適量腸道內(nèi)容物，加入Buffer SSL 緩沖液充分混勻，以Hi-Pure Stool DNA Kits 提取腸道細菌DNA，采用擴增16S rRNA 基因V3+V4 區(qū)的PCR 試劑盒進行擴增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)AMPure XP Beads 試劑盒純化后以ABI Step One Plus Real-Time PCR System 定量，然后于Hiseq2500 系統(tǒng)PE250 模式下進行pooling 測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理與分析將測序得到的DNA 序列去除低質(zhì)量序列、Tags 拼接、Tags 過濾和Tags 嵌合體去除，得到有效數(shù)據(jù)（Effective Tags）后，應(yīng)用Uparse 9（usearch v9.2.64）軟件進行Effective Tags 序列聚類（OTUs），QIIME 和SPSS 23.0 軟件進行鴨腸道菌群Alpha 多樣性分析，經(jīng)Muscle（v3.8.31）和TreeBeST（v1.9.2）軟件進行Beta 多樣性分析，RDP classifier 軟件進行腸道菌群物種注釋分類，LEFse 軟件進行腸道菌群物種差異性分析。

2 結(jié) 果

2.1 DEV 感染鴨腸道菌群Alpha 多樣性分析經(jīng)QIIME 軟件計算OTU 種類數(shù)，繪制OTU 稀釋曲線，結(jié)果顯示：隨著測序深度增加，所測樣本相應(yīng)OTU數(shù)目也相應(yīng)增加（圖1）。表明所有樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠大，能夠充分反映實驗鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)的真實情況。

圖1 感染組和對照組鴨腸道樣本菌群OTU 稀釋曲線Fig.1 OTU dilution curve of duck intestinal flora of control and infection groups

Alpha 多樣性分析結(jié)果顯示：感染組和對照組鴨腸道樣本菌群Coverage 指數(shù)均大于99%，提示其測序結(jié)果可代表所測鴨腸道樣本菌群結(jié)構(gòu)的真實情況；與對照組比較，感染組鴨腸道菌群的Alpha 多樣性指數(shù)（Observed species、Shannon、Simpson、Chao1和ACE）均呈先升高后降低的趨勢，即在DEV 感染后24 h、48 h 和72 h 時Alpha 多樣性指數(shù)升高，隨后96 h 和120 h 呈下降趨勢（圖2）。表明感染后24 h、48 h 群落較豐富和群落多樣性較好，提示感染后一段時間正常菌群也開始大量生長，以維持腸道穩(wěn)態(tài)。

2.2 DEV 感染鴨腸道菌群Beta 多樣性分析經(jīng)Beta多樣性分析，制作Weighted Unifrac 指數(shù)熱圖，結(jié)果顯示，感染組或?qū)φ战M各時間段間樣本W(wǎng)eighted Unifrac 指數(shù)距離較近即相似度較高；感染組24 h、48 h 和72 h 時樣本W(wǎng)eighted Unifrac 指數(shù)與對照組距離差異顯著（p＜0.05），而在96 h 和120 h 時與對照組距離差異極顯著（p＜0.01）。表明隨著DEV 感染時間的延長，樣本間具有顯著的微生物群落差異。

圖2 Alpha 多樣性分析結(jié)果Fig.2 The results of Alpha diversity analysis

2.3 DEV 感染鴨腸道菌群在不同分類水上的物種分布應(yīng)用RDP classifier 軟件對DEV 感染鴨腸道菌群物種注釋分類，結(jié)果如圖3 所示。

2.3.1 DEV 感染鴨腸道菌群在門水平上物種分布在門水平上，對照組和感染組不同時間段鴨腸道菌群均可注釋到15 個門細菌上，即厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）、 軟壁菌門（Tenericutes）、 黏膠球形菌門（Lentisphaerae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、 異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、迷蹤菌門（Elusimicrobia）、 芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Parcubacteria 門和綠彎菌門（Chloroflexi），其中優(yōu)勢菌門主要是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）。與對照組比較，感染組24 h、48 h 和72 h 時厚壁菌門細菌數(shù)量升高，但差異不顯著（p＞0.05），而在96 h 和120 h時下降，差異顯著（p＜0.05）；感染組各個時間段變形菌門細菌呈逐漸下降趨勢，差異顯著（p＜0.05）；感染組各個時間段梭桿菌門細菌呈升高趨勢，但在24 h、48 h 和72 h 時差異不顯著（p＞0.05），而在96 h和120 h 時差異顯著（p＜0.05）；感染組各個時間段擬桿菌門細菌呈升高趨勢，其中48 h 和72 h 時差異顯著（p＜0.05）。

2.3.2 DEV 感染鴨腸道菌群在綱水平上物種分布在綱水平上，感染組和對照組不同時間段鴨腸道菌群均可注釋到44 個綱細菌上，其中優(yōu)勢菌綱為梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、梭桿菌綱（Fusobacteriia）、丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）、Negativicutes 綱、丹毒絲菌綱（Erysipelotrichia）和芽孢桿菌綱（Bacilli）。與對照組比較，感染組24 h、48 h 和72 h 時梭菌綱（Clostridia）和Negativicutes 綱細菌數(shù)量升高，而在96 h 和120 h 時下降，但差異均不顯著（p＞0.05）；感染組擬桿菌綱（Bacteroidia）細菌均呈升高趨勢，其中在48 h 和72 h 時差異顯著（p＜0.05）；感染組梭桿菌綱（Fusobacteriia）細菌也呈升高趨勢，其中在96 h 和120 h 時差異顯著（p＜0.05）；感染組丙型變形菌綱（Gammaproteobacteria）和芽孢桿菌綱（Bacilli）細菌均呈下降趨勢，差異顯著（p＜0.05）。

2.3.3 DEV 感染鴨腸道菌群在目水平上物種分布在目水平上，感染組和對照組不同時間段鴨腸道菌群均可注釋到59 個目細菌上，其中優(yōu)勢菌目為梭菌目（Clostridiales）、擬桿菌目（Bacteroidales）、梭桿目（Fusobacteriales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、月牙單胞菌目（Selenomonadales）、丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）和乳桿菌目（Lactobacillales）。與對照組比較，感染組鴨腸道梭菌目（Clostridiales）和月牙單胞菌目（Selenomonadales）細菌數(shù)量在24 h、48 h 和72 h時升高，而在96 h 和120 h 時下降，但差異均不顯著（p＞0.05）；感染組擬桿菌目（Bacteroidales）和梭桿目（Fusobacteriales）細菌均呈升高趨勢，其中擬桿菌目（Bacteroidales）細菌在48 h 和72 h 時和梭桿目（Fusobacteriales）細菌在96 h 和120 h 時差異顯著（p＜0.05）；感染組丹毒絲菌目（Erysipelotrichales）細菌呈下降趨勢，其中在96 h 和120 h 時下降顯著（p＜0.05）；感染組腸桿菌目（Enterobacteriales）和乳桿菌目（Lactobacillales)在各個時間段均呈下降趨勢，且差異顯著（p＜0.05）。

圖3 對照組和感染組鴨腸道樣本菌群物種分布堆疊圖Fig.3 Stacking diagram of the horizontal species distribution

2.3.4 DEV 感染鴨腸道菌群在科水平上物種分布感染組和對照組不同時間段鴨腸道菌群均可注釋到109 個科細菌上，其中優(yōu)勢菌科為擬桿菌科（Bacteroidaceae）、梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、腸 桿 菌 科（Enterobacteriaceae）、理 研 菌 科（Rikenellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、梭菌科（Clostridiaceae_1）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）和韋榮球菌科（Veillonellaceae）。與對照組比較，感染組鴨腸道擬桿菌科（Bacteroidaceae）、梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、理研菌科（Rikenellaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）和韋榮球菌科（Veillonellaceae）細菌均呈升高趨勢，其中擬桿菌科（Bacteroidaceae）在48 h 和72 h 時、梭桿菌科（Fusobacteriaceae）在96 h 和120 h 時、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）在120 h 時、理研菌科（Rikenellaceae）在72 h 時和毛螺菌科（Lachnospiraceae）在48 h 和72 h 時升高顯著（p＜0.05）；感染組消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）和丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）細菌均呈下降趨勢，其中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）在各個時段和消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）與丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）在96 h 和120 h 時下降顯著（p＜0.05）；感染組梭菌（Clostridiaceae_1）細菌在24 h和48 h 時下降，而在72 h、96 h 和120 h 時上升，但差異均不顯著（p＞0.05）。

2.3.5 DEV 感染鴨腸道菌群在屬水平上物種分布感染組和對照組不同時間段鴨腸道菌群均可注釋到252 個屬細菌上，其中優(yōu)勢菌屬為梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸桿菌志賀菌亞屬（Escherichia-Shigella）、另枝菌屬（Alistipes）、巨 單 胞 菌 屬（Megamonas）、Prevotellaceae_NK3B31.groupg 屬、 Turicibacter 屬、 Candidatus_Arthromitus屬、梭菌屬（Clostridium）和糞桿菌屬（Faecalibacterium）。與對照組比較，感染組鴨腸道梭桿菌屬（Fusobacterium）、擬 桿 菌 屬（Bacteroides）和另枝菌屬（Alistipes）均呈升高趨勢，其中梭桿菌屬（Fusobacterium）在96 h 和120 h 時、擬桿菌屬（Bacteroides）在48 h和72 h 時和另枝菌屬（Alistipes）在72 h 時升高顯著（p＜0.05）；大腸桿菌志賀菌亞屬（Escherichia-Shigella）和Turicibacter 屬細菌均呈下降趨勢，其中大腸桿菌志賀菌亞屬（Escherichia-Shigella）在各個時段和Turicibacter 屬在96 h 和120 h 時差異顯著（p＜0.05）；巨單胞菌屬（Megamonas）、Prevotellaceae_NK3B31.groupg屬、Candidatus_Arthromitus 屬和糞桿菌屬（Faecalibacterium）細菌均呈先升高（24 h、48 h 和72 h）后下降（96 h 和120 h），但差異均不顯著（p＞0.05）；梭菌屬（Clostridium）細菌則先下降（24 h、48 h 和72 h，p＞0.05）后升高（96 h 和120 h，p＜0.05）。

2.3.6 DEV 感染鴨腸道菌群在種水平上物種分布在種水平上，除未歸類外，感染組和對照組不同時間段鴨腸道菌群可注釋到113 個種細菌上。將其中幾個種細菌與對照組比較，感染組鴨腸道Bacteroides_plebeius_DSM_17135、 Gut_metagenom、 Bacteroides_coprocola_DSM_17136 、bacteriumic1379 和 壞 死 梭桿菌（Fusobacterium mortiferum）均呈升高趨勢，其中Gut_metagenome 和 Bacteroides_coprocola_DSM_17136在72 h 時、bacteriumic1379 在24 h 時和壞死梭桿菌（Fusobacterium mortiferum）在96 h 和120 h 時升高顯著（p＜0.05）；產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）呈先下降（24 h、48 h 和72 h，p＞0.05）和后升高（96 h 和120 h，p＜0.05）態(tài)勢。

2.4 DEV 感染鴨腸道菌群物種差異的LEFse 分析通過LEFse 分析組間菌群差異，結(jié)果顯示，感染組在24 h 時鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組差異不顯著（p＞0.05），而在48 h、72 h、96 h 和120 h 時差異顯著（p＜0.05），48 h 時，感染組鴨腸道乳桿菌目、芽孢桿菌綱、腸桿菌科和腸桿菌目細菌相對豐度減少，而毛螺菌科、產(chǎn)堿桿菌科（Alcaligenaceae）、克里斯滕森菌科（Christensenellaceae）Christensenellaceae_R_7_group 屬細菌含量增多；72 h 時，感染組鴨腸道Chloroplast 綱及Chloroplast 綱Phaseolus_acutifolius目、 Phaseolus_acutifolius 科、 Phaseolus_ acutifolius屬和Phaseolus_acutifolius 屬含量減少，而擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目、瘤胃菌科、Bacteroides_coprocola_DSM_17136 等細菌含量增多；96 h 時，感染組鴨腸道厚壁菌門、變形菌門丙型變形菌綱腸桿菌科腸桿菌目大腸桿菌志賀菌亞屬、鏈球菌科等細菌含量減少，而梭桿菌門梭桿菌綱梭桿菌科梭桿菌目梭桿菌屬乳酸發(fā)酵類梭菌（Lactatifermentans）等含量增多；120 h 時，感染組鴨腸道變形菌門丙型變形菌綱腸桿菌目腸桿菌科大腸桿菌志賀菌亞屬及消化鏈球菌科和芽孢桿菌綱等細菌含量減少，而Epsilonproteobacteria 綱、彎曲菌目（Campylobacterales）、彎 曲 菌 科（Campylo bacteraceae）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、Clostridium_perfringens、Ruminococcaceae_UCG_008、lactatifermentans 等 含 量增多（圖4）。

圖4 對照組和感染組鴨腸道樣本菌群物種差異LEFse 分析圖Fig.4 LEFse diagram of horizontal species distribution

3 討 論

研究腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化對維持宿主健康具有重要的意義。腸道菌群的組成與宿主的營養(yǎng)、代謝和免疫等密切相關(guān)，腸道菌群能降解和發(fā)酵宿主不需要的一些碳水化合物以提高能量利用率；同時還能促進產(chǎn)生免疫原，激活免疫系統(tǒng)，有助于抵抗病原體攻擊，增強動物機體免疫抵抗力。在正常情況下，腸道菌群之間、菌群與宿主之間處于動態(tài)平衡， 從而維持著腸道正常生理功能[4]。但當(dāng)動物機體受到病原微生物侵襲時，腸道菌群動態(tài)平衡受到破壞，導(dǎo)致腸道有益菌數(shù)量減少而有害菌數(shù)量增多，同時引起宿主免疫功能下降，從而造成疫病的發(fā)生和病情的加重[5-6]。

本研究采用高通量測序技術(shù)分析DEV 感染后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 時鴨腸道菌群多樣性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性和豐度，隨著DEV 感染時間的延長呈先上升后下降趨勢，且菌群結(jié)構(gòu)差異逐漸加大。推測可能是DEV 感染引起鴨機體免疫功能下降，導(dǎo)致腸道菌群動態(tài)平衡遭到破壞，一些外籍菌乘虛而入并大量繁殖，同時腸道原籍菌為維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)亦大量繁殖，從而造成此時菌群多樣性和豐度較高、結(jié)構(gòu)差異距離較??；但隨著病程發(fā)展，鴨腸道粘膜出血壞死和絨毛脫落，使附著在腸黏膜上的細菌隨之脫離腸壁而排出體外，再加上腸道受損，缺乏良好的細菌生長條件感染，導(dǎo)致腸道細菌大量死亡，因此感染后期腸道菌群多樣性和豐度降低、結(jié)構(gòu)差異距離越大。

本研究發(fā)現(xiàn)DEV 感染后鴨腸道菌群物種在門水平上主要為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，在綱水平主要為梭菌綱、丙型變形菌綱、擬桿菌綱和梭桿菌綱；在目水平上主要為梭菌目、腸桿菌目、擬桿菌目和梭桿菌目；在科水平上主要為腸桿菌科、消化鏈球菌科、擬桿菌科和梭桿菌科；在屬水平上主要為大腸桿菌志賀菌亞屬、擬桿菌屬、梭菌屬和Turicibacter 屬。DEV 感染后，這些細菌含量有的呈升高趨勢，有的呈下降趨勢，有的呈先升高后下降，有的呈先下降后升高，這與李東亮等研究結(jié)果相類似[7]，說明鴨腸道菌群優(yōu)勢菌呈現(xiàn)動態(tài)變化，這可能與腸道微生物保持平衡以緩解損傷有關(guān)；當(dāng)動物機體遭受病原微生物感染時，會做出特定的微生態(tài)反應(yīng)維持腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的動態(tài)穩(wěn)定，以促進動物機體對抗病原侵害。

本研究還發(fā)現(xiàn)DEV 感染后鴨腸道菌群可注釋歸類到種只有113 個種，但值得注意的是，DEV 感染后腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌和壞死梭桿菌均呈先下降后升高趨勢。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種具有莢膜、能產(chǎn)生多種侵襲性酶和外毒素的溫和厭氧菌，能感染豬、牛、羊、雞、鴨、鵝等多種動物，引起腸毒血癥、壞死性腸炎等[8]；壞死梭桿菌是一種廣泛分布于動物腸道內(nèi)的多形態(tài)、革蘭氏陰性的嚴格厭氧菌，能產(chǎn)生多種致病因子如內(nèi)毒素、白細胞毒素、溶血素和蛋白水解酶類等，可引起多種動物壞死性病變[9]。DEV 感染鴨的主要病變?yōu)檠軗p傷和消化道黏膜出血壞死，推測與產(chǎn)氣莢膜梭菌和壞死梭桿菌含量升高存在一定的關(guān)聯(lián)，這有待進一步驗證。