白俊慧，柳愛春，何欣

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 實(shí)驗(yàn)中心，浙江 杭州 310024)

氟蟲腈(Fipronil)，是一種廣譜殺蟲劑，通過作用于α-氨基丁酸受體(GABA)阻斷昆蟲的神經(jīng)膜氯離子通道，從而實(shí)現(xiàn)殺滅跳蚤、螨、虱等害蟲的目的。鑒于其針對(duì)性好的特點(diǎn)，氟蟲腈曾在全球范圍內(nèi)被廣泛運(yùn)用[1]。2017年，由于某養(yǎng)雞場工人使用了混有氟蟲腈的消毒液而引發(fā)的“毒雞蛋”事件，在歐洲引起了一場食品安全危機(jī)[2]。隨著氟蟲腈毒理研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，氟蟲腈在進(jìn)入小鼠體內(nèi)后會(huì)迅速發(fā)生代謝反應(yīng)并散布體內(nèi)各組織，尤其是在皮下脂肪組織和毛囊中會(huì)發(fā)生明顯的富集效應(yīng)，即使是在用藥1周之后，小鼠體內(nèi)仍會(huì)檢測到較高濃度的氟蟲腈及其代謝物殘留[3]。Lyons[4]發(fā)現(xiàn)，施用了氟蟲腈的小鼠，甲狀腺細(xì)胞會(huì)顯著增多，并最終導(dǎo)致腫瘤的生成。這意味著，對(duì)人類而言，氟蟲腈存在較高的致癌風(fēng)險(xiǎn)?！岸倦u蛋”事件后，歐盟等針對(duì)蛋類中氟蟲腈的最大殘留量作了明確規(guī)定，但我國GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》食品中農(nóng)藥最大殘留限量中仍未規(guī)定蛋類中的氟蟲腈最大殘留量。

雞蛋作為價(jià)美質(zhì)優(yōu)的蛋白質(zhì)來源，是我國城鄉(xiāng)居民飲食結(jié)構(gòu)的重要組成部分[5]。雞蛋分為蛋黃和蛋清2個(gè)部分：蛋清由水、蛋白質(zhì)、少量的碳水化合物和微量的脂肪構(gòu)成；而蛋黃中則含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)，以及少量的碳水化合物[6]。本研究擬利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法實(shí)現(xiàn)對(duì)雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的快速、高效檢測，并研究氟蟲腈及其代謝物在蛋黃與蛋清中的分布特點(diǎn)，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters Xevo TQ-S液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)；METTLER電子天平，感量0.01 g和0.000 1 g；Eppendorf 5810臺(tái)式離心機(jī)；IKA磁力攪拌器和漩渦混勻器；IKA T18 Basic型高速組織勻漿機(jī)；Thermo 10～100 μL、100～1 000 μL、1～5 mL移液器。

氟蟲腈粉末(源葉生物，純度≥98%)；氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，1 000 μg·mL-1)；乙腈、甲醇、乙酸銨均為色譜純，購于Fisher Chemical公司；甲酸，色譜純，購于ROE Scientific公司；無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、氯化鈉為分析純，購于中國醫(yī)藥集團(tuán)。

0.22 μm微孔有機(jī)濾膜，固相萃取小柱，購于Waters公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 樣品制備與前處理

選取健康產(chǎn)蛋期母雞30只，將雞分成2組，每組15只。通過飲水的方式使雞攝入氟蟲腈。試驗(yàn)組每只雞按15 mg·kg-1(以體重計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)喂服銳勁特(氟蟲腈)溶液，連喂3 d；空白組雞正常飲水?？瞻捉M與試驗(yàn)組每天的飲水量保持一致。從喂藥當(dāng)天開始采集試驗(yàn)組與空白組雞所產(chǎn)雞蛋，收集好的雞蛋拿回實(shí)驗(yàn)室待測，總計(jì)收集雞蛋的時(shí)間持續(xù)(3+21)d。

取雞蛋樣品，分離蛋清和蛋黃，分別置于50 mL離心管中，混勻，分別稱取混勻后的蛋清和蛋黃樣品各5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL離心管中，參照GB 23200.115—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》，分別對(duì)蛋黃和蛋清進(jìn)行提取和凈化，取上清液過0.22 μm濾膜，以待測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

分別準(zhǔn)確移取1.0 mL氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀釋至100 mg·kg-1作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-20 ℃冰箱中保存。配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用50%的甲醇-水溶液逐級(jí)稀釋，分別配置成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色/質(zhì)譜條件優(yōu)化

1.4.1 質(zhì)譜條件

采用直接注射方式進(jìn)樣，對(duì)氟蟲腈及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg·mL-1)進(jìn)行質(zhì)譜采集，同時(shí)利用控制變量法對(duì)保留時(shí)間、定量離子對(duì)、碰撞能量、定性離子對(duì)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.2 色譜條件

參照GB 23200.115—2018，選取C18作為色譜柱，乙酸銨-甲酸溶液作為流動(dòng)相A，甲醇作為流動(dòng)相B。洗脫程序：0～3.0 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)40%～30%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)60%～70%；3.0～3.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)30%～2%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)70%～98%；3.5～4.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)2%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)98%；4.5～6.0 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)2%～40%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)98%～60%。試驗(yàn)中對(duì)流動(dòng)相條件和洗脫時(shí)間梯度進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 前處理方法優(yōu)化

通過考查圖譜和回收率的方式比較QuEChERS方法(組成成分為PSA/C18)和固相萃取法(SPE)對(duì)蛋黃和蛋清中氟蟲腈及其代謝物的凈化效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜檢測參數(shù)確定

采用直接注射方式進(jìn)樣，對(duì)氟蟲腈及其3種代謝物進(jìn)行信號(hào)采集，質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 氟蟲腈及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)選用C18為色譜柱，在洗脫時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)為98%時(shí)已實(shí)現(xiàn)了完全洗脫，因此將洗脫梯度程序修改如下：0～2.0 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)40%～30%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)60%～70%；2.0～2.2 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)30%～2%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)70%～98%；2.2～2.7 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)2%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)98%；2.7～4.5 min，流動(dòng)相A體積分?jǐn)?shù)2%～40%，流動(dòng)相B體積分?jǐn)?shù)98%～60%。4種分析物的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示，各目標(biāo)物均得到較好的保留和分離。

2.3 凈化效果評(píng)價(jià)

選取空白樣本作為基質(zhì)加標(biāo)，分別向蛋清和蛋黃中加入2、5、10 mg·kg-1的氟蟲腈及其代謝物混標(biāo)，經(jīng)提取、凈化步驟后上機(jī)檢測。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，使用QuEChERS法對(duì)蛋黃和蛋清提取物分別進(jìn)行凈化，其中，QuEChERS方法凈化劑的配比為50 mg PSA、50 mg C18和150 mg無水硫酸鎂。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：QuEChERS方法凈化時(shí)，蛋清中氟蟲腈及其代謝物的加標(biāo)回收率在90.0%～110.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～5.8%；而蛋黃中由于含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，在使用QuEChERS法進(jìn)行凈化后，仍受到較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)干擾，回收率僅在60%～85%。采用SPE凈化時(shí)，蛋清中氟蟲腈及其代謝物的加標(biāo)回收率在94.3%～107.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～5.2%；蛋黃中氟蟲腈及其代謝物的加標(biāo)回收率則大幅提高至90.0%～106.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0%～6.1%。出于成本和效率的綜合考慮，最終試驗(yàn)中，蛋清使用QuEChERS方法凈化，蛋黃使用SPE凈化。

圖1 優(yōu)化后的4種待測物液相色譜

2.4 蛋清與蛋黃中氟蟲腈及其代謝物的分析

應(yīng)用所建立的方法對(duì)采集的雞蛋樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)雞蛋中檢測到的藥物殘留量最高的為氟蟲腈砜，此外，氟蟲腈在雞蛋中也有較高檢出濃度。本試驗(yàn)中，氟蟲腈藥物進(jìn)入雞體后，雞蛋中檢測到的主要物質(zhì)為氟蟲腈的代謝殘留物氟蟲腈砜和氟蟲腈，以及少量的氟甲腈。用藥的第2天，蛋黃與蛋清中開始檢測到氟蟲腈砜和氟蟲腈；用藥的第3天，蛋黃與蛋清中出現(xiàn)了氟甲腈殘留。氟蟲腈進(jìn)入雞體后，藥物殘留的濃度會(huì)呈現(xiàn)出一個(gè)顯著升高后逐漸降低的特征。蛋清中，氟甲腈、氟蟲腈和氟蟲腈砜的濃度分別在用藥后的第9天、第4天、第9天左右達(dá)到最大值，之后逐漸降低；蛋黃中，氟甲腈、氟蟲腈和氟蟲腈砜的濃度分別在用藥后的第12天、第8天、第9天左右達(dá)到最大值，之后逐漸降低。其中，氟蟲腈和氟蟲腈砜殘留在蛋黃中的濃度為蛋清中的3倍。在停藥3周后，雞蛋中仍有氟蟲腈和氟蟲腈砜的殘留檢出。

3 小結(jié)

本研究以氟蟲腈為研究對(duì)象，改進(jìn)檢測和凈化方法，分別對(duì)蛋黃、蛋清中的氟蟲腈及其代謝殘留物進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可實(shí)現(xiàn)對(duì)雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的快速、準(zhǔn)確、高靈敏度篩查，其中，蛋清宜使用QuEChERS方法凈化，而蛋黃宜使用SPE凈化。同時(shí)，利用建立的檢測方法，探索了氟蟲腈在雞蛋內(nèi)的代謝規(guī)律。向雞連續(xù)飼喂15 mg·kg-1(以體重計(jì))的氟蟲腈溶液3 d，雞蛋中檢測到的藥物殘留量最高的為氟蟲腈的代謝殘留物氟蟲腈砜，其次為氟蟲腈，以及少量的氟甲腈。用藥的第2天，蛋黃與蛋清中開始檢測到氟蟲腈砜和氟蟲腈；用藥的第3天，蛋黃與蛋清出現(xiàn)氟甲腈殘留，停藥3周后，雞蛋中仍有氟蟲腈和氟蟲腈砜的殘留檢出。試驗(yàn)結(jié)果對(duì)今后深入開展雞蛋中氟蟲腈及其代謝物的攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有指導(dǎo)意義，同時(shí)還可為進(jìn)一步探究雞體內(nèi)氟蟲腈的代謝轉(zhuǎn)換規(guī)律提供數(shù)據(jù)支撐。