火 艷，招雪晴，黃厚毅，黃賢斌，許云方，祝遵凌,，苑兆和,

（1. 南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3. 南京林業(yè)大學(xué) 藝術(shù)設(shè)計學(xué)院，江蘇 南京 210037）

石榴Punica granatum是千屈菜科Lythraceae石榴屬Punica落葉小喬木或灌木，在中國約2 000 a的栽培史，200余個品種[1?2]。常分為食用石榴和觀賞石榴，觀賞石榴株型優(yōu)美，花期長，花色艷，春葉紅、秋葉黃，果實奇特，可觀性果實宿存樹體時間長，是春、夏、秋3季可賞的重要花木，廣泛應(yīng)用于園林綠化、盆栽、盆景等[2?3]。目前國內(nèi)外的研究主要集中于利用分子標記對石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析和評價[4?11]，以及對食用石榴果實形態(tài)及生化指標的測定分析[12?17]，對觀賞資源的遺傳多樣性研究較少。MARTINEZ-NICOLAS等[18]對53個西班牙品種的果實、種子、葉、花等性狀進行過表型研究，但沒有針對樹型、枝型、花型、瓣化雄蕊數(shù)等觀賞性狀的綜合分析。陳俊愉等[19]根據(jù)株型、花、果、葉片大小將國內(nèi)觀賞石榴分為花石榴和果石榴，其中花石榴分為一般種與矮生種，再依據(jù)花色和單、重瓣分類。汪小飛[20]將包括觀賞石榴在內(nèi)的全國87個石榴品種分為單瓣、復(fù)瓣、重瓣、臺閣4個品種群。王慶軍等[21]對35份種質(zhì)資源進行了表型性狀的初步調(diào)查，但未對表型性狀多樣性及親緣關(guān)系進行綜合評價。表型多樣性是遺傳多樣性與觀賞植物評價的重要基礎(chǔ)，全面了解石榴種質(zhì)的優(yōu)異性狀，可為石榴種質(zhì)資源的鑒定、保存和推廣提供參考。C值指生物體單倍體細胞核的DNA總質(zhì)量，C值的變異對研究物種的親緣關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育具有重要意義，結(jié)合倍性水平分析也可用來鑒定雜交物種[22]。目前中國石榴品種‘泰山紅’‘Taishanhong’大笨籽’‘Dabenzi’和‘大籽’‘Dazi’被鑒定為二倍體，美國品種‘Nana’為四倍體[23?25]。多倍體植物具有花大、果實大、植株健壯、抗逆性強等優(yōu)點，是育種的好材料。流式細胞術(shù)作為快速準確測定倍性與基因組含量的先進技術(shù)，可為石榴種質(zhì)資源的創(chuàng)新與遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。本研究對24個觀賞石榴品種的株型、枝型、花型、1年生小枝顏色、花瓣色、花萼色、花長、花寬、花萼長、花萼寬、花萼瓣數(shù)、花瓣數(shù)、瓣化雄蕊數(shù)等13個觀賞性狀進行了表型多樣性分析、主成分分析與聚類分析，并利用流式細胞儀對24個品種進行了倍性及C值測定，為觀賞石榴種質(zhì)資源的評價、創(chuàng)新與遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為生長良好且無病蟲害的24個觀賞石榴品種(表1)，其中單瓣品種群(single-flower group)8個、復(fù)瓣品種群(semi-double-flower group)4個、重瓣品種群(double-flower group)11個、臺閣品種群 (proliferation-flower group)1 個。

1.2 方法

1.2.1 觀賞性狀測定 試驗于2018年5月在中國石榴種質(zhì)資源圃(嶧城)和南京林業(yè)大學(xué)進行，每品種隨機選擇3株生長健壯、無病蟲害、長勢一致的植株進行各表型性狀的調(diào)查和統(tǒng)計。其中質(zhì)量性狀6 個：株型 (plant form，PF)、枝型 (brach type，BT)、花型 (flower pattern，F(xiàn)P)、1 年生小枝顏色 (color of branch，BC)、花瓣色 (color of petal，PC)、花萼色 (color of sepal，SC)。數(shù)量性狀 7 個：花長 (flower length，F(xiàn)L)、花寬 (flower diameter，F(xiàn)D)、花萼長 (sepal length，SL)、花萼寬 (sepal diameter，SD)、花萼瓣 數(shù) (number of sepals， NOS)、 花 瓣 數(shù) (number of petals， NOP)、 瓣 化 雄 蕊 數(shù) (number of petaloid stamens，NOPS)。用直尺或游標卡尺測量長度，小數(shù)點后保留2位有效數(shù)；用國際通用的英國皇家園藝學(xué)會比色卡(RHSCC)測量顏色，記錄數(shù)字編碼。調(diào)查取樣標準根據(jù)《植物新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性測試指南 石榴屬》的操作進行[26]。

1.2.2C值與倍性鑒定 以二倍體石榴‘大笨籽’為外標，選用LB01解離液。濾網(wǎng)、熒光染料、鞘液、培養(yǎng)皿、試劑均購自南京博巧生物技術(shù)有限公司。分別取各石榴品種嫩葉，用流式細胞儀(Influx，美國BD公司)測定倍性與C值，具體參照林峰等[27]方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 觀賞性狀數(shù)據(jù)處理 質(zhì)量性狀均以 1～6級進行分級和賦值 (表 2)，數(shù)量性狀根據(jù)平均值 (X)和標準差 (δ)分為 10 級，1 級＜X?2δ，10 級≥X+2δ，中間每級相差 0.5δ[28?29]。各性狀的遺傳多樣性采用Shannon’s信息指數(shù) (H')進行評價：H'= ?∑(Pi)(lnPi)，其中Pi表示第i種變異類型出現(xiàn)的頻率[30]。采用Excel進行性狀數(shù)據(jù)(平均值、最大值、最小值、極差和變異系數(shù)等)的基本統(tǒng)計。使用SPSS 24.0軟件計算表型數(shù)據(jù)的KMO檢驗值及Bartlett球形度檢驗的顯著性。種質(zhì)間距為平方歐式距離，聚類方法采用Ward法。

1.3.2C值及倍性數(shù)據(jù)處理 熒光染料 PI的激發(fā)波長為 488 nm，收集通道為 FL2(670 nm±30 nm)，檢測PI的發(fā)射熒光強度。使用Influx自帶軟件FACSTM Sortware進行分析?！蟊孔选蚪M大小為328 Mbp[23]，C值為0.33 pg，根據(jù)公式[31]：待測樣本的細胞核DNA含量或倍性=對照樣本細胞核DNA含量或倍性×(待測樣本G0/G1峰熒光強度/對照樣本G0/G1峰熒光強度)。變異系數(shù)(VC)控制在8%以內(nèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀賞石榴質(zhì)量性狀多樣性

根據(jù)表2對觀賞石榴品種的6個主要質(zhì)量性狀進行分級和賦值，統(tǒng)計各性狀的頻率分布和多樣性指數(shù)，由表3可知：各性狀多樣性指數(shù)為0.512～1.683，平均為1.148。多樣性指數(shù)最大的性狀為花瓣色，其次為花萼色、花型和1年生小枝顏色，多樣性指數(shù)均大于1.000；其中，花瓣色以橙黃(25.00%)、橙紅(25.00%)為主，花萼色以橙黃(41.67%)為主，花型以重瓣為主(45.83%)，1年生小枝顏色以粉紅(62.50%)為主。多樣性指數(shù)最小的性狀是株型，其次是枝型；其中，株型主要為喬木型(79.17%)，枝型主要為開張型(58.33%)。

2.2 觀賞石榴數(shù)量性狀多樣性

24個觀賞石榴的7個數(shù)量性狀表現(xiàn)了廣泛的變異，變異系數(shù)為11.76%～117.59%(表4)，多樣性指數(shù)為1.456～1.910，多樣性指數(shù)平均為1.715，高于質(zhì)量性狀，說明觀賞石榴數(shù)量性狀多樣性更豐富。7個性狀中瓣化雄蕊數(shù)的變異系數(shù)最大，達117.59%，花瓣數(shù)次之，為78.86%，而花萼瓣數(shù)、花長、花萼長的變異系數(shù)較小。多樣性指數(shù)最大的性狀是花萼長(1.910)，其次是花長(1.906)、花寬(1.802)、花萼寬(1.683)、花瓣數(shù)(1.630)、花萼瓣數(shù)(1.619)、瓣化雄蕊數(shù)(1.456)，多樣性指數(shù)均大于1.600。

表 4 觀賞石榴品種數(shù)量性狀統(tǒng)計Table 4 Morphological diversity of statistics of quantitative of ornamental pomegranate cultivars

2.3 不同觀賞石榴品種群表型多樣性比較

根據(jù)汪小飛[20]方法將觀賞石榴品種劃分為3個品種群，即單瓣品種群、復(fù)瓣品種群、重瓣品種群。由表5可知：3個品種群的表型性狀多樣性指數(shù)分別為0.813、0.600和1.157，其平均多樣性指數(shù)為0.856，表明不同觀賞石榴品種群之間，表型性狀的多樣性指數(shù)均有不同程度的差異。其中，重瓣品種群表型多樣性指數(shù)最高，除枝型外，其他12個性狀均高于所有品種相應(yīng)性狀的平均值，特別是花瓣數(shù)、瓣化雄蕊數(shù)、花萼寬、花寬和1年生小枝顏色。單瓣品種群的株型、枝型、1年生小枝顏色、花萼色、花長和花萼寬的多樣性指數(shù)均高于所有品種相應(yīng)性狀的平均值。由此可見：3個品種群中，重瓣品種群的表型性狀遺傳多樣性最豐富，其次是單瓣品種群，復(fù)瓣品種群的表型遺傳多樣性最低。

表 5 不同觀賞石榴品種群形態(tài)多樣性指數(shù)Table 5 Morphological diversity index of different ornamental pomegranate cultivars

2.4 觀賞石榴表型多樣性的主成分分析

供試觀賞石榴表型性狀的KMO檢驗值為0.622(高于0.600)，Bartlett球形度檢驗顯著性為0.000(低于0.050)，符合主成分分析條件。以特征值大于1為標準提取主成分，前4個主成分的累計貢獻率為80.10%，認為這4個主成分能充分反映13個表型性狀(表6)。第1主成分的特征值為4.52，貢獻率為34.74%，特征向量絕對值較大的為枝型、1年生小枝顏色、花長、花萼寬，說明第1主成分是枝的形態(tài)顏色與花大小的綜合反映。第2主成分的特征值為2.62，貢獻率為20.17%，特征向量絕對值較大的為花型、株型、瓣化雄蕊數(shù)，說明第2主成分是花瓣數(shù)及花瓣形成、株型的綜合反映。第3主成分的特征值為2.06，貢獻率為15.82%，特征向量絕對值較大的為花瓣數(shù)、花萼瓣數(shù)、花瓣色，說明第3主成分是花瓣數(shù)、花大小、花色的綜合反映。第4主成分的特征值為1.22，貢獻率為9.39%，特征向量絕對值較大的為花萼長，說明第3主成分是花大小的綜合反映。由此得出：枝的形態(tài)與顏色、花大小、花瓣數(shù)及花瓣形成、株型、花色是造成觀賞石榴表型差異的主要影響因子。

2.5 觀賞石榴表型多樣性的聚類分析

根據(jù)表型性狀和主成分分析結(jié)果進行變量篩選，單因素方差分析發(fā)現(xiàn)：對聚類貢獻較大的變量為花萼長、花萼瓣數(shù)、花瓣數(shù)、瓣化雄蕊數(shù)、株型、枝型、花型、1年生小枝顏色和花瓣色9個指標，構(gòu)建聚類圖(圖1)。在遺傳距離為11～12時，觀賞石榴品種分為3個組群：組群Ⅰ、組群Ⅱ、組群Ⅲ。其中，組群Ⅰ包括6個重瓣品種群和4個復(fù)瓣品種群；組群Ⅱ包括8個單瓣品種群和1個重瓣品種群；組群Ⅲ包括4個重瓣品種群和1個臺閣品種群。在遺傳距離14～15時，組群Ⅰ和組群Ⅱ聚在一起，說明組群Ⅰ和組群Ⅱ遺傳關(guān)系較近，兩者與組群Ⅲ的遺傳關(guān)系均較遠。進一步分析，4個白花類品種(‘嶧城重瓣白花酸’‘南林重瓣白’‘洛陽白馬寺’‘榴花雪’)聚在一起，1年生小枝顏色為淺綠色的品種也都是白花品種，全部聚在一起，說明白花品種的遺傳關(guān)系較近。3個復(fù)色品種(‘榴緣白’‘嶧城重瓣瑪瑙’‘南林重瓣瑪瑙’)也聚在一起。除了‘青皮月季’以外，4個矮生品種(‘榴花雪’‘榴花紅’‘墨石榴’‘宮燈石榴’)聚在一起，表明矮生品種間遺傳關(guān)系較近。

表 6 觀賞石榴品種多樣性的主成分分析Table 6 Principle component analysis of morphological diversity of ornamental pomegranate cultivars

圖 1 觀賞石榴品種表型性狀聚類圖Figure 1 Clustering figure of ornamental pomegranate cultivars based on phenotypic characters

對各類組群個體的數(shù)量性狀取平均值，質(zhì)量性狀計算個數(shù)，得到各組群的特征(表7)。組群Ⅰ的特征為：花長最大、花萼長最大、花萼瓣數(shù)最少，絕大多數(shù)為喬木型，主要為開張型，重瓣略多于復(fù)瓣，1年生小枝主要為粉紅色和淺綠色，花瓣色主要為白色、粉色、橙紅，花萼色主要為橙黃、黃色。組群Ⅱ的特征為：花長最小、花寬最小、花萼長最小、花萼寬最小、花瓣數(shù)最小、瓣化雄蕊數(shù)最小，主要為喬木型，直立型和開張型各占一半，絕大多數(shù)為單瓣，1年生小枝顏色主要為粉紅色，花瓣色主要為橙黃和橙紅，花萼色主要為橙黃。組群Ⅲ的特征為：花寬最大、花萼寬最大、花萼瓣數(shù)最大、花瓣數(shù)最大、瓣化雄蕊數(shù)最大，主要為喬木型、開張型、重瓣，1年生小枝顏色主要為粉紅色，花瓣色主要為復(fù)色，花萼色主要為橙黃和紅色。

表 7 觀賞石榴各組群形態(tài)特征Table 7 Morphological characteristics of different ornamental pomegranate cultivars groups after cluster

2.6 觀賞石榴基因組 C值及倍性分析

流式細胞儀測定結(jié)果表明(表8)：24個觀賞石榴品種均為二倍體，C值范圍為0.28～0.39 pg，品種間C值差異較大。其中，單瓣品種群、復(fù)瓣品種群、重瓣品種群及臺閣品種群的平均C值分別為0.34、0.32、0.34和0.33 pg，可見由花型劃分的各品種群之間C值相差不大。白花品種群、粉花品種群、紅花品種群及復(fù)色花品種群的平均C值分別為0.34、0.32、0.34和0.32 pg，可見由花色劃分的各品種群之間C值相差不大。中國品種、美國品種、突尼斯品種的平均C值分別為0.33、0.35和0.34 pg，各地品種C值相差不大。

表 8 觀賞石榴倍性及 C值Table 8 Ploidy level and C-value of 24 ornamental pomegranate cultivars

3 討論

種質(zhì)資源的調(diào)查和評價是研究品種起源、演化、馴化的基礎(chǔ)，對優(yōu)異資源篩選、品種選育具有重要意義[32]。利用表型性狀分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性直觀易行，能快速了解植物的遺傳變異水平[33]。本研究發(fā)現(xiàn)：24個觀賞石榴品種具有豐富的表型多樣性，平均形態(tài)多樣性指數(shù)為1.453，數(shù)量性狀多樣性指數(shù)(1.715)大于質(zhì)量性狀(1.148)，與前人對紫薇Lagerstroemia indica[28]、香瓜Cucumis melo[34?35]等的表型多樣性研究觀點基本相符。其中，花瓣色、花萼色2個質(zhì)量性狀和花長、花寬、花萼長、花萼寬、花萼瓣數(shù)、花瓣色、瓣化雄蕊數(shù)7個數(shù)量性狀變異明顯，多樣性指數(shù)高于1.400。

值得注意的是，各數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)與變異系數(shù)變化趨勢不一致。與其他數(shù)量性狀相比，瓣化雄蕊數(shù)和花瓣數(shù)的多樣性指數(shù)較小，分別為1.456和1.630，小于平均值(1.715)；但兩者的變異系數(shù)最大，分別為117.59%和78.86%，大于平均值41.82%。多樣性指數(shù)代表變異分布的均勻度，變異系數(shù)代表變異的離散程度。不一致的變化趨勢說明變異的范圍很大，且變異的分布不均勻，與張海平等[36]對睡蓮Nymphaea tetragona的表型研究類似，同時符合TILMAN[37]關(guān)于多樣性指數(shù)和變異系數(shù)之間關(guān)系的觀點。另外，變異系數(shù)在一定程度上反映了進化的快慢，瓣化雄蕊數(shù)和花瓣數(shù)的變異系數(shù)大說明重瓣和雄蕊瓣化程度高的品種，自然品種形成較晚；人工育種加速了雄蕊瓣化和花瓣數(shù)量的增多，這與杜鵑花Rhododendron simsii[38]、矮牽牛Petunia hybrid等[39]、日本龍膽花Gentiana scabra等[40]等觀賞植物品種選育方向一致，說明觀賞石榴的選育也是朝著花瓣數(shù)增多、雄蕊瓣化的方向進行。

胡標林等[41]認為：利用株高、芒等表型性狀能夠明確水稻Oryza sativa核心種質(zhì)的親緣關(guān)系。本研究聚類結(jié)果表明：24個觀賞石榴品種可劃分為3個組群，其遺傳聚類與花型、顏色、株型關(guān)系密切。其中，單瓣品種與復(fù)瓣品種、部分重瓣品種的親緣關(guān)系較近，另一部分重瓣品種與臺閣品種的親緣關(guān)系較近，這與陳俊愉[42]的花卉品種分類體系提出的花型演化觀點相同。而依據(jù)花瓣色劃分，橙色花品種與粉色花品種、白色花品種的親緣關(guān)系較近，與復(fù)色花品種的親緣關(guān)系較遠，與張啟翔[43]對紫薇品種群的劃分方法相同。

MOSLEMI等[44]、JBIR等[45]在對突尼斯和伊朗石榴的研究中認為：石榴品種間親緣關(guān)系與地理環(huán)境的相關(guān)性不強。本研究聚類結(jié)果表明：來源南京的品種并沒有聚在一起，分散在3個組群中，該結(jié)果同樣支持上述觀點。王慶軍等[21]通過內(nèi)部簡單序列重復(fù)(ISSR)將嶧城35個觀賞石榴分為6個組群，發(fā)現(xiàn)依據(jù)分子標記劃分的大類中有不同的花色和花型，認為基于分子性狀的親緣關(guān)系與基于花色、花型等表型性狀的親緣關(guān)系不一致。本研究中，基于多個表型性狀的聚類結(jié)果只有小部分與王慶軍等[21]的分子標記劃分結(jié)果一致；趙麗華等[46]在利用ISSR對47個石榴栽培品種的聚類研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的矛盾。觀賞石榴品種在繁殖栽培過程中大量的地區(qū)間引種交流以及長期的自然選擇和人工選擇下積累了豐富的遺傳變異，使得某些品種在遺傳信息上可聚為一類，但形態(tài)特征和地理來源卻有較大差異，因此，對觀賞石榴品種的遺傳關(guān)系的研究時，需進一步選擇合適的分子標記開展分子水平的親緣關(guān)系分析，結(jié)合本研究的形態(tài)聚類結(jié)果共同評判與討論。

千屈菜科倍性復(fù)雜，大多為多倍體物種[47]。該科的紫薇屬Lagerstroemia中，桂林紫薇L.guilinensis是四倍體，云南紫薇L.intermedia、大花紫薇L.speciosa和西雙紫薇L.venusta是六倍體，毛萼紫薇L. balansae為非整倍體[48]。本研究發(fā)現(xiàn)：引種自各地的24個觀賞石榴品種均為二倍體，說明從倍性來看，石榴屬品種遺傳相對穩(wěn)定，可進一步探究石榴多倍體育種的可能性，比較二倍體石榴與多倍體石榴的表型差異與遺傳差異。

本研究中觀賞石榴品種主要是單瓣類、復(fù)瓣類、重瓣類，而臺閣類品種的數(shù)量較少。故還需廣泛收集不同類別的品種資源，并結(jié)合分子生物學(xué)證據(jù)，開展更為廣泛的觀賞石榴遺傳多樣性、品種分類研究。

4 結(jié)論

觀賞石榴種質(zhì)資源具有豐富的表型遺傳多樣性，以花的數(shù)量性狀最為突出，其中瓣化雄蕊數(shù)和花瓣數(shù)的變異系數(shù)分別為117.59%和78.86%。聚類分析可分為3大組群，組群Ⅰ和組群Ⅱ聚在一起，兩者與組群Ⅲ的親緣關(guān)系均較遠，其遺傳聚類與花型、顏色、株型關(guān)系密切，暗示著花色、花型在栽培觀賞石榴的馴化育種過程中的重要指示性作用。24個觀賞石榴品種均為二倍體，顯示出石榴觀賞品種較強的遺傳穩(wěn)定性。