■盧文麒 何英霞 梁 英 陳學(xué)豪* 翟少偉，2

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門(mén)361021；2.福建省水產(chǎn)生物育種與健康養(yǎng)殖工程研究中心，福建廈門(mén)361021）

研究表明，飼料中高水平組胺會(huì)導(dǎo)致肉食性魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基并使其代謝失衡，降低肝臟抗氧化酶活性，造成肝臟氧化應(yīng)激和正常肝細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致生長(zhǎng)受到抑制[1-7]。為了緩解魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖中的氧化應(yīng)激，在飼料中添加植物多酚成為近年來(lái)魚(yú)類(lèi)抗應(yīng)激添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，特別是葡萄籽原花青素（GSPs）因其能夠清除魚(yú)體內(nèi)多種自由基，維持肝細(xì)胞膜的正常通透性，減少肝臟轉(zhuǎn)氨酶的釋放，降低丙二醛水平，提高肝臟抗氧化能力，改善內(nèi)臟器官健康而備受關(guān)注[8-9]。GSPs能增強(qiáng)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）肝胰臟和珍珠龍膽石斑魚(yú)（Epinephelus lanceolatus×Epinephelus fuscoguttatus♀）肝臟的抗氧化能力[10-12]，提高熱應(yīng)激下綠唇鮑抗氧化能力和存活率[13]。GSPs在緩解飼料組胺脅迫方面，僅有改善美洲鰻鱺（Anguilla rostrata）生長(zhǎng)性能和腸道健康的報(bào)道[14]，對(duì)美洲鰻鱺肝臟健康是否具有保護(hù)作用未知。因此，本試驗(yàn)以美洲鰻鱺為試驗(yàn)動(dòng)物，研究在飼料組胺脅迫下添加GSPs 對(duì)美洲鰻鱺血清轉(zhuǎn)氨酶活性和肝臟抗氧化能力的影響，為GSPs 在鰻鱺飼料中的利用開(kāi)發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動(dòng)物美洲鰻鱺幼魚(yú)由廈門(mén)市同安區(qū)北溪鰻魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)提供。選擇健康、規(guī)格接近、平均體重為（10.84±0.16）g 的美洲鰻鱺幼魚(yú)480 尾進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分4 個(gè)處理組（每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾），即對(duì)照組、HIS組、HIS+GSPs組Ⅰ、HIS+GSPs組Ⅱ，其中對(duì)照組投喂基礎(chǔ)飼料，其他組投喂在基礎(chǔ)飼料中分別添加300 mg/kg組胺、300 mg/kg組胺+300 mg/kg GSPs和300 mg/kg 組胺+600 mg/kg GSPs 的試驗(yàn)飼料，試驗(yàn)期為77 d。

1.2 試驗(yàn)飼料

基礎(chǔ)飼料為福州海馬飼料有限公司生產(chǎn)的幼鰻配合飼料，主要由白魚(yú)粉、紅魚(yú)粉、淀粉、酵母粉、膨化大豆及復(fù)合預(yù)混料組成，營(yíng)養(yǎng)水平為粗蛋白46.58%、粗灰分12.35%、粗脂肪6.70%、水分7.36%。配制4種試驗(yàn)飼料，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別將組胺、GSPs與基礎(chǔ)飼料逐級(jí)混勻（組胺添加量為300 mg/kg，飼料實(shí)測(cè)水平為534 mg/kg），分裝于自封袋中，-20 ℃冷凍保存。組胺（C5H9N3，有效含量為98.2%）由上海源葉生物技術(shù)有限公司提供，配制飼料前將顆粒狀研磨至粉末狀；葡萄籽原花青素（GSPs，有效含量為98%）為葡萄籽中提取純化的粉末狀產(chǎn)品，由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院海水場(chǎng)開(kāi)展，將480尾美洲鰻鱺置于兩個(gè)無(wú)循環(huán)水圓形養(yǎng)殖桶（直徑為1.10 m,高為0.80 m,注水量為800 L）暫養(yǎng)兩周。暫養(yǎng)期間投喂基礎(chǔ)飼料，按料水比為1∶1.1 混合，手工制成面團(tuán)狀定時(shí)投喂，投喂1 h 后清除糞便。定時(shí)監(jiān)測(cè)水質(zhì)狀況，維持水溫為24～28 ℃，pH 值為7.2～7.9，溶氧濃度為7.0～9.0 mg/l，氨氮＜0.10 mg/l，亞硝酸鹽＜0.005 mg/l，日換水量為1/3～1/2。試驗(yàn)開(kāi)始后，將健康、規(guī)格相近的美洲鰻鱺隨機(jī)分到16 個(gè)具有循環(huán)水裝置的圓形養(yǎng)殖桶（直徑為0.60 m，高為1.40 m，注水量為320 L）中，投餌率為每桶中魚(yú)總重的1.5%左右，每日投喂兩次（6：00和18：00），每次投餌1 h后采用虹吸管收集各養(yǎng)殖桶底的殘餌和清除糞便。每天觀察美洲鰻鱺幼魚(yú)的攝食與生長(zhǎng)狀況，記錄日投喂量、死亡數(shù)量，水質(zhì)與暫養(yǎng)期間一致。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)第11周結(jié)束后，停食24 h，從各養(yǎng)殖桶中隨機(jī)取9尾美洲鰻鱺，放入無(wú)水乙醇配制成2 g/l丁香酚中短暫麻醉，尾靜脈取血，靜置于4 ℃冰箱內(nèi)8 h，待凝固分層后，于4 ℃離心機(jī)下離心（3 000 r/min）10 min，取上層血清，-80 ℃凍存待測(cè)。美洲鰻鱺取血后，迅速將其解剖，分離出肝臟，稱(chēng)量肝臟，并用4 ℃無(wú)菌去離子水清洗表面的血漬，液氮保存12 h 后，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存。取肝臟樣品于4 ℃下解凍，漂洗，濾紙拭干及稱(chēng)量，按質(zhì)量（g）∶體積（ml）=1∶9的比例加入預(yù)冷生理鹽水，采用玻璃勻漿機(jī)制成10%勻漿，在4 ℃條件下3 500 r/min 離心10 min,，取上清轉(zhuǎn)移至離心管中，-80 ℃保存待測(cè)。

1.5 試驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定

血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性，肝臟超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛(MDA)水平的測(cè)定均嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，用SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan's 法對(duì)存在顯著差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 GSPs對(duì)飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(見(jiàn)圖1)

圖1 GSPs對(duì)飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺血清轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

由圖1 可知，與對(duì)照組相比，HIS 組血清GPT 和GOT 活性顯著升高（P＜0.05）；HIS+GSPs 組與對(duì)照組和HIS 組接近（P＞0.05），HIS+GSPs 組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.2 GSPs對(duì)飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺肝臟抗氧化指標(biāo)的影響(見(jiàn)圖2)

由圖2 可見(jiàn)，HIS 組美洲鰻鱺肝臟T-AOC 和CAT活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），GSH 和MDA 水平無(wú)顯著變化（P＞0.05）；HIS+GSPs 組美洲鰻鱺肝臟TAOC、GSH水平和CAT活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化（P＞0.05），但HIS+GSPs 組Ⅰ的MDA 水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；HIS+GSPs 組美洲鰻鱺肝臟CAT 活性顯著高于HIS 組（P＜0.05），MDA 水平顯著低于HIS 組（P＜0.05），HIS+GSPs 組Ⅱ美洲鰻鱺肝臟T-AOC 和GSH 水平顯著高于HIS 組（P＜0.05）；HIS+GSPs 組Ⅰ、Ⅱ間各指標(biāo)均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。所有組間SOD活性均無(wú)變化（P＞0.05）。

3 討論

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GPT）屬于細(xì)胞內(nèi)酶，正常條件下受細(xì)胞膜的屏障保護(hù)不易滲出，當(dāng)魚(yú)類(lèi)肝細(xì)胞受損或器官功能障礙發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液，因此血清轉(zhuǎn)氨酶的變化可以評(píng)價(jià)肝細(xì)胞受損的程度[15]。本試驗(yàn)中，HIS 組美洲鰻鱺血清的GOT 和GPT 活性顯著高于對(duì)照組，這與蘭菲菲[1]在美洲鰻鱺飼料中添加300 mg/kg 組胺，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高的結(jié)果一致，說(shuō)明飼料組胺對(duì)美洲鰻鱺肝臟有損傷作用。而在飼料組胺脅迫下添加GSPs，血清中GOT 和GPT活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，表明GSPs 能夠緩解飼料組胺對(duì)肝臟的損傷。飼料鎘脅迫下在吉富羅非魚(yú)飼料中添加400 mg/kg GSPs、珍珠龍膽石斑魚(yú)飼料中添加800 mg/kg GSPs 可降低血清的GOT 和GPT 活性[10-11]。GSPs 降低血清的GPT、GOT 活性，緩解肝臟損傷可能與其直接發(fā)揮抗氧化能力，清除過(guò)多自由基有關(guān)；還可能與其減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，保持脅迫下肝細(xì)胞完整性有關(guān)[5,16]。

總抗氧化能力（T-AOC）可以反映魚(yú)體對(duì)外界脅迫下分解與清除自由基的代謝能力，是綜合評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的指標(biāo)[17]。谷胱甘肽（GSH）是機(jī)體重要的抗氧化因子，能清除損傷細(xì)胞的活性氧，維持生物體內(nèi)氧自由基的代謝平衡[18]；超氧化物歧化酶（SOD）能清除氧化應(yīng)激產(chǎn)生的超氧化自由基，減輕自由基對(duì)肝細(xì)胞的損傷[16]；過(guò)氧化氫酶（CAT）屬于含F(xiàn)e3+的血蛋白酶，能清除SOD 反應(yīng)后產(chǎn)生的H2O2，也可阻止ROS對(duì)肝細(xì)胞的損傷，在肝抗氧化防御體系中發(fā)揮重要的作用[19]；丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，由自由基誘導(dǎo)膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生，可與蛋白質(zhì)、氨基酸殘基等發(fā)生交聯(lián)聚合反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞有損傷作用，是評(píng)估氧化應(yīng)激引起肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化程度的指標(biāo)[20]。

圖2 GSPs對(duì)飼料組胺脅迫下美洲鰻鱺肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，HIS 組中GSH 水平有降低趨勢(shì)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的GSH不能滿足正常的生理功能，而T-AOC 水平和CAT 活性顯著降低。說(shuō)明本試驗(yàn)條件下飼料組胺可降低美洲鰻鱺肝臟抗氧化能力。這與投喂含高組胺的飼料可顯著降低黃顙魚(yú)肝臟SOD、CAT 活性，升高M(jìn)DA 水平，造成肝臟氧化損傷的研究結(jié)果一致[21-22]。飼料組胺降低肝臟抗氧化能力的原因可能是過(guò)量的自由基大量消耗抗氧化酶，致使肝內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝能力減弱；也與刺激肝臟快速釋放IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α等炎癥因子從而激活NF-кB 通路，引起炎性反應(yīng)過(guò)激造成肝細(xì)胞損傷有關(guān)[4,23]。

本試驗(yàn)中，與HIS 組相比，HIS+GSPs 組美洲鰻鱺肝臟CAT活性顯著升高，MDA水平顯著降低；僅HIS+GSPs 組Ⅱ美洲鰻鱺肝臟T-AOC 和GSH 水平顯著升高；HIS+GSPs 組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組接近。說(shuō)明GSPs能提高美洲鰻鱺肝臟清除自由基和抗氧化能力，一定程度緩解飼料組胺脅迫的氧化損傷。這與吉富羅非魚(yú)飼料添加400 mg/kg GSPs 減少自由基的產(chǎn)生，緩解100 mg/kg鎘脅迫下肝胰臟氧化損傷結(jié)果類(lèi)似[24]。此外，添加800 mg/kg GSPs可提高300 mg/kg飼料鎘脅迫下珍珠龍膽石斑魚(yú)肝臟CAT活性和降低MDA水平[11]；添加47.6 mg/kg GSPs可提高熱應(yīng)激綠唇鮑SOD活性[13]。GSPs 提高不同脅迫下肝臟抗氧化能力可能的途徑是：①通過(guò)分子結(jié)構(gòu)的多個(gè)酚羥基直接捕獲氧化過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，清除過(guò)多的ROS，提高抗氧化酶活性和非酶系物質(zhì)水平等維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡[10]。②阻止脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的啟動(dòng)，消除機(jī)體被脅迫下脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中的中間產(chǎn)物L(fēng)OO-，阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈延長(zhǎng)，中斷自由基鏈反應(yīng)，降低MDA 水平[25]。③其分子結(jié)構(gòu)中的羥酚基通過(guò)螯合金屬離子(如Fe3+、Cu2+、Al3+)，鈍化金屬離子的活性，抑制催化自由基反應(yīng)[26]。④通過(guò)調(diào)節(jié)GSH 氧化還原循環(huán)來(lái)改善細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，提高GSH清除自由基和活性氧的能力[27]。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料組胺脅迫下添加300 mg/kg GSPs即可降低美洲鰻鱺的血清轉(zhuǎn)氨酶活性及肝臟丙二醛水平，提高肝臟抗氧化能力，緩解飼料組胺脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，改善肝臟健康狀態(tài)。