■周 璞 王 濤 劉 碩 張保平 常 娟 王 平 尹清強*

（1.河南省舞鋼市畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，河南舞鋼462599；2.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450046；3.河南省葉縣動物疫病預防控制中心，河南葉縣467200；4.鶴壁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務中心，河南鶴壁458000）

自1960 年英國火雞暴發(fā)霉菌毒素(Mycotoxin)事件，世界各地對霉菌毒素中毒癥進行了大量調(diào)查研究。據(jù)報道，每年因為受到霉菌毒素污染的作物和農(nóng)產(chǎn)品所造成的經(jīng)濟損失就達數(shù)千億美元[1]。霉菌毒素是霉菌在其所污染的谷物或飼料中所產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物。含有霉菌毒素的飼料或其原料能夠?qū)π笄蒺B(yǎng)殖業(yè)以及飼料行業(yè)造成嚴重影響，已知的霉菌毒素有300多種，其中對人和動物有較嚴重危害的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)和嘔吐毒素(DON)等[2]。

黃曲霉毒素是由黃曲霉、溜曲霉、集蜂曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生，黃曲霉毒素對作物和糧食的污染一般是在田間生長階段就會污染，當貯藏條件不好或所處環(huán)境濕度較高，也會導致霉菌爆發(fā)生長，對糧食、飼料和食物均可導致毒素污染。霉菌毒素污染問題關(guān)系到飼料安全、動物生產(chǎn)和食品安全，甚至還威脅到人類自身健康。防治霉菌毒素危害已成為養(yǎng)殖場、飼料廠以及食品廠生產(chǎn)管理的重中之重。據(jù)報道，2018年上半年收集到的166份小麥、玉米、魚粉、豆粕和麩皮等飼料原料樣品中AFB1 的檢出率為100%，最高值達79.55 μg/kg，遠遠超過國家規(guī)定的限量標準[3]。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)，是由禾谷鐮刀菌和半裸鐮孢等真菌產(chǎn)生，具有類雌激素活性，可導致畜禽的繁殖障礙。通過調(diào)查結(jié)果表明，ZEA是我國飼料原料以及配合飼料檢出含量最高的霉菌毒素之一[4]。一般情況下，玉米赤霉烯酮的污染主要是通過農(nóng)作物收割前感染霉菌所致，因此ZEA 也被稱為“田間毒素”[5]。ZEA 污染糧食后，在加工過程中不易消滅，跟隨相應體系進入飼料行業(yè)、動物養(yǎng)殖行業(yè)甚至食品加工領(lǐng)域，引起嚴重的食品安全問題最終甚至危害人類的自身健康[6]。龔阿瓊等[7]從黑龍江、廣西、重慶和河北等地共收集樣品63 份，在飼料及飼料原料中ZEA 檢出率為80%，玉米副產(chǎn)物ZEA 檢出率高達100%，含量最高值為794.06 μg/kg。

霉菌毒素的脫毒法有物理、化學和生物學方法，研究證實生物降解法避免了物理法和化學法的諸多不足，是一種最理想的霉菌毒素解毒法。據(jù)報道，乳酸菌發(fā)酵脫毒的反應條件溫和，可以保持樣品的營養(yǎng)物質(zhì)不變，改善風味，在降解毒素的同時沒有有毒的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等[8]。Cho等[9]從ZEA污染較高的谷物、污水、土壤中篩選得到一株枯草芽孢桿菌亞種，對ZEA具有較好的降解作用。劉暢等[10]篩選到了對AFB1吸附效果較好的釀酒酵母，取得了比較滿意的結(jié)果。本研究通過響應面回歸設(shè)計，得到最佳的復合益生菌配伍分別對AFB1 和ZEA 進行生物降解，為消除霉菌毒素的危害及維護動物健康提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%、NaCl 1%、酵母浸粉0.5%，用蒸餾水定容至1 L，用NaOH溶液調(diào)節(jié)使pH值為7.0。

YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨2%、葡萄糖2%、酵母浸粉1%，用蒸餾水定容至1 L。

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、酵母浸粉1%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.2%、檸檬酸二銨0.2%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、吐溫80 1 ml，用蒸餾水定容至1 L。

上述三種培養(yǎng)基在121 ℃、1.034×105Pa 條件下高壓蒸汽滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌種的活化與培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別接種到LB和YPD培養(yǎng)基上，分別在37 ℃和30 ℃及200 r/min條件下培養(yǎng)24 h；干酪乳桿菌接種到MRS培養(yǎng)基上，37 ℃靜止狀態(tài)下培養(yǎng)24 h。三種菌分別按2%的接種量接入以上對應的新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。

1.3 復合益生菌體外降解霉菌毒素的響應面回歸設(shè)計

將枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、干酪乳桿菌的活菌數(shù)皆調(diào)至1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU/ml，利用表1的響應面回歸設(shè)計，測定不同益生菌組合降解霉菌毒素的效果。

霉菌毒素的降解率（%）=（對照組中霉菌毒素含量-試驗組中霉菌毒素含量）/對照組中霉菌毒素含量×100

利用Box-Behnken Design (BBD)設(shè)計、模型擬合和數(shù)據(jù)分析，得出回歸方程。根據(jù)線性回歸方程，得出降解霉菌毒素的最佳益生菌組合。

表1 試驗設(shè)計因素及編碼水平(CFU/ml)

為了體現(xiàn)自變量和因變量的關(guān)系，采用二次多項方程進行擬合，預測二次多項方程式如下：

1.4 復合益生菌對ZEA生物降解的設(shè)計

1.4.1 ZEA標準品的制備

將3 mg ZEA 標準品溶解到3 ml 甲醇中，混勻后取0.1 ml 溶于1.9 ml 甲醇中，使ZEA 濃度為50 mg/l，放于-20 ℃冰箱中備用。

1.4.2 復合益生菌降解ZEA的響應面回歸設(shè)計

對照組：1.95 ml 生理鹽水+ 3 ml MRS 培養(yǎng)基+0.05 ml ZEA標準品(50 mg/l)。試驗組：不同體積的三種益生菌，分別加入0.05 ml ZEA 標準品(50 mg/l)及3 ml MRS 培養(yǎng)基，再加生理鹽水補足5 ml。該設(shè)計共有18 個試驗組，每個試驗組3 個重復，每個重復設(shè)定ZEA含量為500 μg/l。

1.4.3 降解ZEA的測定

各處理組在37 ℃及200 r/min恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，然后在4 ℃及10 000 r/min 的離心機中離心5 min，取一定量上清液，按ZEA試劑盒推薦的操作步驟進行霉菌毒素含量測定。

1.5 復合益生菌對AFB1生物降解的設(shè)計

1.5.1 AFB1標準品的制備

將3 mg AFB1 標準品溶到3 ml 的甲醇中，混勻后取0.1 ml 溶于0.9 ml 的甲醇中，使得溶液濃度為100 mg/l，再用甲醇稀釋10 倍，使?jié)舛葹?0 mg/l，放于-20 ℃冰箱中待用。

1.5.2 復合益生菌體外降解AFB1的響應面回歸設(shè)計

對照組：1.975 ml 生理鹽水+3 ml MRS 培養(yǎng)基+0.025 ml AFB1標準品(10 mg/l)。試驗組：不同體積的三種益生菌，分別加入0.025 ml AFB1標準品(10 mg/l)及3 ml MRS 培養(yǎng)基，再加生理鹽水補足5 ml。該設(shè)計共18 個試驗組，每個試驗組3 個重復，每個重復設(shè)定AFB1含量為50 μg/l。

1.5.3 降解AFB1的測定

利用AFB1試劑盒進行測定，試驗及操作步驟同上。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6 軟件對響應面數(shù)據(jù)進行分析。采用SPSS17統(tǒng)計分析軟件對各組數(shù)據(jù)進行方差分析和Duncan's法多重比較，差異顯著性用P＜0.05 表示，所有結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果

2.1 降解ZEA的最佳益生菌組合

根據(jù)Design Expert 8.0.6 軟件中Box-Behnken 試驗設(shè)計，設(shè)計了18個試驗點的響應面分析試驗，其中對照組24 h后ZEA含量為511.53 μg/l，計算試驗組ZEA的降解率，并對其進行回歸建立響應面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗結(jié)果與回歸方程方差分析見表2和表3。利用Design-Expert 8.0.6對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得出回歸模型方程為：Y=-22.65-58.73X1+27.00X2+39.87X3+5.40X12-0.57X1X2+0.86X1X3-1.95X22-0.30X2X3-3.52X32。

表2 Box-Behnken設(shè)計參數(shù)與ZEA降解率

從表3 可以看出，上述模型P=0.000 2，表明該模型統(tǒng)計學上有顯著性，有意義。在顯著水平(P＜0.05)條件下，總ZEA 降解率回歸模型中枯草芽孢桿菌X1(P＜0.000 1)、干酪乳桿菌X2(P=0.031 9)，這兩種因素對響應值有顯著影響。X12(P=0.000 4)與X32(P=0.004 2)表現(xiàn)顯著，表明在枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母個體間有較好的降解ZEA 作用?；貧w模型的決定系數(shù)為R2=0.968 1和R2adj=0.927 1，說明回歸方程的擬合度較好，可以較好地解釋模型的變化。因此，可用此模型對復合益生菌降解ZEA 的效果進行分析和預測?；陧憫娣治?，通過軟件模擬尋優(yōu)，當枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)分別為1×107、1×105CFU/ml和1×106CFU/ml時，降解毒素ZEA效果最好，實測降解率為36.42%，預測值為34.50%。

2.2 最佳益生菌組合降解AFB1響應面分析

根據(jù)Design Expert 8.0.6 軟件 中Box-Behnken 試驗設(shè)計，設(shè)計了18個試驗點的響應面分析試驗，其中對照組24 h 后AFB1 含量為43.63 μg/l，計算試驗組AFB1 的降解率并對其進行回歸，建立響應面二次回歸模型，尋求最優(yōu)因素水平，試驗結(jié)果與回歸方程方差分析見表4 和表5。利用Design-Expert 8.0.6 對數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得出回歸模型方程為：Y=80.346-10.64X1-17.86X2+5.51X3+1.13X12-0.38X1X2+0.16X1X3+1.57X22+1.02X2X3-0.83X32。

表3 ZEA降解率響應面回歸方程系數(shù)的方差分析

表4 Box-Behnken設(shè)計參數(shù)與AFB1降解率

從表5 可以看出，上述模型P=0.002 2，表明該模型統(tǒng)計學上有顯著性，有意義。在顯著水平(P＜0.05)條件下，回歸模型中枯草芽孢桿菌X1(P=0.032 7)、干酪乳桿菌X2(P＜0.000 1)、產(chǎn)朊假絲酵母X3(P=0.003 2)，這些因素對響應值有顯著影響。失擬項P=0.021 0，即方程模型失擬不是極顯著，說明方程的擬合度可以?；貧w模型的決定系數(shù)為R2=0.935 0和R2adj=0.851 4，說明回歸方程的擬合度好，可以較好地解釋模型的變化。因此，可用此模型對復合益生菌組合對AFB1 降解效果進行分析和預測。

基于響應面分析，通過軟件模擬尋優(yōu)，當枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌與產(chǎn)朊假絲酵母的活菌數(shù)分別為1×106、1×107CFU/ml與1×107CFU/ml時，降解毒素AFB1效果最好，實測降解率為49.58%，預測值為47.58%。

3 討論

關(guān)于利用單一微生物進行降解ZEA 的研究有很多。據(jù)報道，研究人員從霉變玉米以及玉米地土壤中篩選出了4 株可降解ZEA 的芽孢桿菌[11]。Lei 等[12]得到一株枯草芽孢桿菌，具有高效降解ZEA 的能力，該菌株對飼料以及霉變玉米中ZEA 的降解率在84%以上。通過研究枯草芽孢桿菌降解ZEA的特性，發(fā)現(xiàn)該菌所產(chǎn)的一種胞外酶是降解ZEA作用的活性物質(zhì)[13]。冼嘉雯[14]篩選出一株酵母菌，在含有ZEA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，ZEA殘留量只有3.4%。本研究選用的是三個不同菌屬的菌種組合，雖然對ZEA的降解率不是非常高，但對于下一步益生菌在動物生產(chǎn)中的應用提供了依據(jù)。

表5 AFB1降解率響應面回歸方程系數(shù)的方差分析

有文獻報道，AFB1 與乳酸菌細胞壁的多聚糖等成分相結(jié)合，通過非共價方式形成AFB1-乳酸菌復合物[15]。李志剛等[16]用8 株乳酸桿菌與AFB1 和生理鹽水混合培養(yǎng)，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h和2 h后檢測AFB1含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌吸附效果最好。Bluma 等[17]篩選出的多株芽孢桿菌，皆對黃曲霉以及寄生曲霉類的生長有不同程度的抑制作用。本研究制備的復合益生菌對AFB1降解率達到了49.58%，其中可能包括酶解和吸附兩種作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母以不同的比例組合可顯著地降解AFB1和ZEA，為畜禽生產(chǎn)中霉菌毒素的生物降解及畜產(chǎn)品的安全生產(chǎn)提供了一種新型的微生物飼料添加劑。