胡 敏，曲麗娜，卞立紅，任國領(lǐng)，張奕婷，王金龍

(大慶師范學(xué)院 生物工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163712)

1 引言

宏基因組，最初于1998年由Handelsman等提出，指一個環(huán)境中全部微生物基因組信息，包含可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的。宏基因組技術(shù)屬于高效的組學(xué)技術(shù)。2004年Handelsman[1]發(fā)現(xiàn)宏基因組技術(shù)可以通過對微生物的細(xì)胞直接提取的方法獲得。2010年Wong[1]發(fā)現(xiàn)宏基因組技術(shù)還可以用于研究基因群和酶編碼基因，用于研究生物合成過程的生物活性催化劑和次生物代謝物產(chǎn)量，比如生物活性化合物。目前宏基因組技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生、能源開發(fā)、生物技術(shù)、環(huán)境修復(fù)等方面。本文簡述了宏基因組技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用，包括藥物開發(fā)、人體微生物群落的研究和疾病的診斷和治療。

2 宏基因組基本技術(shù)

2.1 宏基因組 DNA 提取

常用的提取DNA的方法有直接裂解法和細(xì)胞提取法。直接裂解法可以通過物理途徑和化學(xué)途徑，可以利用超聲波、凍融法、表面活性劑、鹽和有機(jī)溶劑等對DNA進(jìn)行提取。細(xì)胞提取法通常采用相應(yīng)酶對細(xì)胞進(jìn)行處理，達(dá)到細(xì)胞破碎的目的。兩種方法各有利弊，其差異取決于細(xì)胞破壁方法。

2.2 宏基因組文庫構(gòu)建

提取后所得到的基因組DNA，經(jīng)過純化處理后進(jìn)行酶切，之后將DNA片段與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)移到生命力旺盛的傳代培養(yǎng)細(xì)胞中并進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程稱為建庫，即構(gòu)建宏基因組文庫[1]。宿主細(xì)胞對轉(zhuǎn)移進(jìn)去的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯表達(dá)，根據(jù)基因功能篩選出所需要的宿主細(xì)胞。建立的宏基因組文庫包含了所有的微生物DNA信息(包括可培養(yǎng)或不可培養(yǎng))，有利于開發(fā)新型的生物活性物質(zhì)。

2.3 目的基因的篩選

隨著宏基因組技術(shù)的發(fā)展，其目的基因的篩選方法也增加了很多，但主要方法仍為功能篩選、序列篩選以及底物誘導(dǎo)基因表達(dá)等。序列篩選是利用PCR或探針直接對基因序列進(jìn)行擴(kuò)增或檢測；功能性篩選是對基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測篩選，目前檢測的基因功能有抗菌活性、酶活性以及溶血活性等；底物誘導(dǎo)基因表達(dá)的篩選方法是由于底物的存在，而引起目的基因的功能酶合成的檢測方法，這種方法在篩選活性酶相關(guān)基因中被利用。宏基因組操作步驟如圖1 。

圖1 宏基因組技術(shù)操作步驟

3 宏基因組技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 宏基因組技術(shù)在藥物開發(fā)方面的應(yīng)用

宏基因組藥物的開發(fā)大部分來源于微生物的次生代謝產(chǎn)物，特別是抗生素。在Doreen E等[2]的研究中，他們構(gòu)建了包括24545個克隆的宏基因組文庫，并對其進(jìn)行篩選，選取了其中3個克隆(p57g4、p214d2、p89c8)，對其進(jìn)行檢測與分析，檢測結(jié)果為妥布霉素和妥布霉素B，這兩種抗生素的抗菌活性較廣，具有廣譜抗菌活性。美國KOSAN科技公司利用宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一系列的天然產(chǎn)品，包括多柔比星、紅霉素、四環(huán)素、Rapamy cin和FK506。Rondon MR等[3]等進(jìn)行了宏基因組文庫的建立，并對其進(jìn)行篩選，選擇出了表達(dá)脂肪酶的克隆基因，發(fā)現(xiàn)其也具有抵抗細(xì)菌的功能。趙晶等[4]構(gòu)建并篩選南極土壤宏基因組文庫，得到具有抗腫瘤活性克隆子13株，運(yùn)用MTT法對活性較高的克隆子進(jìn)行測定，結(jié)果表明AE-3克隆子明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的生長。國外的一些實驗室已經(jīng)在研究宏基因組技術(shù)的非核糖體肽的生物合成，為生物藥物的開發(fā)提供了一個新的想法。

3.2 宏基因組技術(shù)在人體微生物群落研究中的應(yīng)用

一般來說，人的正常菌群在口腔、皮膚、呼吸道、尿道和胃腸道等處都有存在。正常菌群與人體健康密切相關(guān)。他們可以合成并幫助人體吸收一些必需氨基酸和維生素；處理人類飲食中一些難消化的成分，如植物多糖；占據(jù)人體不同的粘膜表面，產(chǎn)生天然抗生素，抑制有害菌的著落和生長等。目前已有許多關(guān)于傳統(tǒng)方法對人類正常菌群進(jìn)行研究，但需要純粹的微生物培養(yǎng)，這限制了對生物體正常菌群的了解，尤其是對不可培養(yǎng)的微生物。宏基因組學(xué)克服了傳統(tǒng)方法的局限性。它既可以研究微生物組成和數(shù)量，也可以了解微生物群落本身與微生物環(huán)境中寄主的進(jìn)化關(guān)系、功能基因的分布及其對人類健康的影響。

3.2.1 在腸道微生物方面的研究

利用宏基因組技術(shù)對比研究了節(jié)段性回腸炎患者和正常人腸道中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)患者腸道中微生物多樣性顯著降低，尤其硬壁菌門的細(xì)菌種類明顯減少[5]，表明人體腸道微生物多樣性與人體健康相互關(guān)聯(lián)?？茖W(xué)家建立人與動物腸道微生物群宏基因組的對比，并對其代謝特征進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌感染可能引起肥厚，腸道內(nèi)的陰溝腸桿菌可能會導(dǎo)致肥胖；Ⅱ型糖尿病不只與糖代謝異常有關(guān)，也與菌群失調(diào)有關(guān)，腸道內(nèi)某些種類的乳酸菌可能影響糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[6]；在化療患者中研究腸道菌群，發(fā)現(xiàn)化療患者的腸道菌群可以通過損傷的腸道黏膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)從而刺激免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，協(xié)助殺傷腫瘤細(xì)胞，結(jié)果表明某些種類的腸道菌群可能導(dǎo)致腸癌的發(fā)生，但現(xiàn)在研究仍不能明確癌癥與腸道菌群的因果關(guān)系[7]。在余佳文[8]研究中認(rèn)為，人類和動物體內(nèi)存在很多適合微生物生存的區(qū)域，例如腸道內(nèi)、口腔以及皮膚表面，宏基因組學(xué)的方法可以用來研究這些區(qū)域中的微生物，特別是在疾病治療上，可以用這種方法來實現(xiàn)對病人病情變化的觀察和治療過程中治療計劃的糾正，達(dá)到醫(yī)治手段能夠及時針對病癥的作用。

3.2.2 在口腔微生物方面的研究

Ling等[9]通過研究無齲兒童和患齲兒童齦上菌斑群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)纖毛菌、鏈球菌、放線菌、毗鄰貧養(yǎng)菌、硫單胞菌和韋榮菌組成的群落與齲病有顯著的相關(guān)性，可以從未患齲個體的微生物群組中尋找有效的抗菌肽和益生菌作為新型的抗齲藥物；Colombo等對牙周炎患者的進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在頑固性和可治療性牙周炎患者齦下菌斑的細(xì)菌種類比健康人多很多，且與健康人相比較還具有更多的牙周炎致病菌，表明牙周炎致病菌與慢性牙周炎相關(guān)；鄧盟等[10]對口腔扁平細(xì)胞癌患者的唾液微生物組進(jìn)行研究，獲得了8門微生物，提示口腔癌伴隨有口腔微生物組的結(jié)構(gòu)的改變，并對口腔細(xì)菌群體中的耐藥基因進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個新的耐四環(huán)素基因tet32 ，其能夠使四環(huán)素失活，口腔微生物組或許可以用于口腔癌的早期診斷。

3.3 宏基因組技術(shù)在疾病診斷與治療方面的應(yīng)用

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的疾病得到攻克，但也有許多疾病還都沒有找到病因，對于那些常規(guī)實驗室檢測不到病因的疾病被定義為未知病因疾病，這些疾病有較高的發(fā)病率和致死率，例如新生兒腹瀉，每年造成180萬人的致死，但至今沒有找到明確的致病病原體。許多諸如流感樣疾病、新生兒腹瀉、阿爾茨海默病、各種形式腫瘤以及其它未知病因疾病都將受益于宏基因組學(xué)，這也將開啟其在公共衛(wèi)生和傳染病防治領(lǐng)域的應(yīng)用。

宏基因組技術(shù)可以對樣本的DNA直接測序，減少了傳統(tǒng)檢測方法的時間和提高了準(zhǔn)確性，快速找出致病病原體，為藥物和疫苗的研發(fā)提供了時間和基礎(chǔ)。菌血癥常常發(fā)生在ICU，因其發(fā)展速度快、并發(fā)癥多和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害到了患者的生命安全，宏基因組技術(shù)可以快速找出致病原并進(jìn)行有效的抗菌治療。Long 等[17]對 78 例 ICU 患者的血漿分別進(jìn)行宏基因組二代測序和血培養(yǎng)，結(jié)果顯示，宏基因組二代測序方法的病原體檢出率為 30.77%，而血培養(yǎng)法僅為 12.82%，表明宏基因組技術(shù)在病原體檢測中具有更高的靈敏性。Abril 等[11]將 1 例膿毒癥患者血漿中的游離細(xì)菌 DNA 進(jìn)行宏基因組測序，24h內(nèi)便檢測出嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌(Capnocytophaga canimorsus)基因序列高度富集，并使用 16s rRNA 測序進(jìn)行確認(rèn)，體現(xiàn)出宏基因組技術(shù)相對傳統(tǒng)檢測方法具有更高的效率。

傳染性疾病的預(yù)防要比治療顯得重要的多，預(yù)防未知病毒對人類的傳入是一項艱巨的任務(wù)，需要相匹配的病毒檢測和鑒定技術(shù)。在過去的十年，我們見證了宏基因組學(xué)技術(shù)在各個領(lǐng)域病毒學(xué)研究中的強(qiáng)大作用，流行病學(xué)研究表明很可能會有新的病毒從植物傳給人類，同時，我們也面臨恐怖分子進(jìn)行病毒襲擊的危險，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)以它快速靈敏的特點(diǎn)，將會在病毒檢測中發(fā)揮傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)及序列依賴方法所不能起的強(qiáng)大力量。盡管宏基因組學(xué)技術(shù)還不是常規(guī)診斷方法的一部分，但是宏基因組學(xué)與人體存在的微生物基因組聯(lián)合使用，用于疾病預(yù)防以及診斷和治療具有重要的意義。

4 宏基因組技術(shù)研究展望

雖然宏基因組技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，但也有局限性。如果DNA提取方法不能獲得環(huán)境中所有微生物的全部基因組信息，就需要改進(jìn)樣品采集和檢測操作。此外，宏基因組技術(shù)涉及到復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析，這些數(shù)據(jù)分析屬于生物信息學(xué)的范疇，因此必須將宏基因組學(xué)與生物信息學(xué)相結(jié)合，可以消除傳統(tǒng)遺傳算法的缺點(diǎn)，如：效率低、成本高和時間成本等?？傊?，隨著檢測手段和高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，宏基因組技術(shù)的應(yīng)用范圍將會越來越廣泛，為生態(tài)環(huán)境以及人類的生存創(chuàng)造更好的條件，有利于更加保證人類合理利用自然、與自然和平相處的幸福健康的生活。

宏基因組在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究屬于剛剛起步階段，但研究前景令人看好。未來有望在以下方面取得突破并得到廣泛的應(yīng)用：不可培養(yǎng)的微生物耐藥機(jī)制以及在傳播中的作用；新型未知感染性疾病的診斷；特殊微生物群體致病機(jī)制的發(fā)現(xiàn)(例如生物膜)；女性陰道微生物群落的平衡與疾病的預(yù)防等。人類宏基因組的研究比較晚，應(yīng)該充分發(fā)揮現(xiàn)有的優(yōu)勢，不斷努力的深入研究克服阻礙，加快研究宏基因組在醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)展。