吳麗萍, 胡亮, 皮回春, 高玉山, 吳曼禎, 黃如純, 魏鳳香

深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心(廣東深圳 518172)

唐氏血清學(xué)篩查(唐篩)是一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、無創(chuàng)的產(chǎn)前篩查方法，通過對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷，確診后及時(shí)終止妊娠，是預(yù)防唐氏兒出生的有效方法。但因侵入性產(chǎn)前診斷存在胎兒丟失風(fēng)險(xiǎn)，不少孕婦心有顧慮。無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)是近年來用于唐篩的新技術(shù)，因其無創(chuàng)及高檢出率等優(yōu)點(diǎn)深受廣大孕婦喜愛。部分唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦選擇先行NIPT篩查，視NIPT結(jié)果后決定是否進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，還有部分孕婦不做唐篩直接行NIPT檢測(cè)，這一做法是否可行？本研究通過分析我院590例唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦胎兒染色體結(jié)果及NIPT檢測(cè)情況，為臨床遺傳咨詢提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年1月至2019年11月以唐篩高風(fēng)險(xiǎn)為指征，在深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心接受羊膜腔穿刺的單胎孕婦590例，所有孕婦進(jìn)行了羊水染色體核型及微陣列分析，在檢測(cè)前均進(jìn)行了遺傳咨詢告知產(chǎn)前診斷的意義、風(fēng)險(xiǎn)及局限性，夫婦雙方知情并簽署同意書，同意臨床信息用于科研，本研究已通過深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 方法

1.2.1 唐篩 空腹采集孕15～20+6周孕婦靜脈血2 mL，2 h內(nèi)離心，分離血清，用Wallac Oy生產(chǎn)的雙標(biāo)檢測(cè)試劑，德國(guó)PerkinElmer1235全自動(dòng)時(shí)間分辨免疫熒光分析系統(tǒng)，將孕婦血清AFP、free-β-hCG、uE3結(jié)果導(dǎo)入Lifecycle4.0風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算軟件，結(jié)合孕婦的孕周、體重、年齡等信息自動(dòng)計(jì)算出風(fēng)險(xiǎn)值。21-三體風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶270判定為高風(fēng)險(xiǎn)；18-三體風(fēng)險(xiǎn)值≥1∶350判定為高風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.2 羊膜腔穿刺術(shù) 唐篩高風(fēng)險(xiǎn)病例在查無穿刺禁忌證后，在超聲引導(dǎo)下使用22G穿刺針(日本八光)經(jīng)腹行羊膜腔穿刺術(shù)，取羊水25～30 mL送遺傳實(shí)驗(yàn)室檢查。

1.2.3 染色體核型分析(CS) 按照技術(shù)規(guī)范行羊水細(xì)胞培養(yǎng)，G顯帶及染色體核型分析，檢查20個(gè)核型，分析5個(gè)核型[1]。核型分析以人類細(xì)遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)2016為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 染色體微陣列分析(CMA, Chromosomal Microarray Analysis) 采用美國(guó)Agilent公司array CGH芯片及技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行分析，用Agilent Genomic Workbench軟件分析檢出的結(jié)果，拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)參考實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)并查詢OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)指南(2015版)，將CNVs分為5類：(1)致病性CNVs；(2)可能致病性CNVs；(3)臨床意義不明CNVs；(4)可能良性CNVs；(5)良性CNVs。

1.2.5 NIPT檢測(cè) 部分唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦在孕12～22+6周抽取5 mL靜脈血，通過孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前檢測(cè)試劑盒(華大基因)進(jìn)行血漿游離DNA提取及文庫(kù)制備，并于BGI SEQ500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過BGI Halos系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析，得出13、18、21號(hào)染色體z值。z值≥3判斷為高風(fēng)險(xiǎn)。若發(fā)現(xiàn)其他染色體存在疑似異常，以附加結(jié)果形式報(bào)告。

1.2.6 妊娠結(jié)局隨訪 對(duì)590例接受介入性產(chǎn)前診斷的孕婦均進(jìn)行隨訪，分別于羊膜腔穿刺術(shù)后2周和產(chǎn)后3～6個(gè)月各隨訪1次，隨訪內(nèi)容包括妊娠結(jié)局和新生兒分娩方式、出生體重、新生兒出生后生長(zhǎng)發(fā)育情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 590例唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦年齡18～48歲，中位年齡為31歲；孕齡15～24周，中位孕齡為18.5周。590例孕婦接受羊膜腔穿刺術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)成功率為100%。

2.2 胎兒染色體結(jié)果 590例唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，528例胎兒核型和微陣列分析均正常，8例(1.36%)胎兒染色體多態(tài)性，24例(4.07%)胎兒染色體核型分析異常，其中21-三體12例(2.03%),18-三體5例(0.85%)，其他染色體異常7例(1.19%)；染色體核型正常，微陣列分析檢出致病性CNVs和可能致病性CNVs共9例(1.52%)，臨床意義不明CNVs共16例(2.71%)，其中9例證實(shí)遺傳自表型正常的父母，7例拒查；雜合性缺失(LOH)者5例(0.85%)。見圖1。

圖1 590例唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦胎兒染色體結(jié)果情況

2.3 染色體陽性病例的NIPT情況 本研究將核型異?；蛭㈥嚵挟惓５牟±暈殛栃圆±?，在54例染色體檢測(cè)陽性病例中有25例術(shù)前已行NIPT檢測(cè)，1例18-三體NIPT檢測(cè)失敗，該病例胎兒游離DNA(cffDNA)含量?jī)H2.6%，其余5例21-三體和1例18-三體均被NIPT檢出；7例NIPT常見非整倍體低風(fēng)險(xiǎn)、其他染色體疑似異常，羊水微陣列分析檢出4例致病性或可能致病性CNVs，2例臨床意義不明CNVs和1例LOH；4例致病性CNVs其NIPT提示低風(fēng)險(xiǎn)，且除病例11超聲提示NT 2.8 mm外，其他病例超聲均未見明顯異常。見表1。

表1 25例染色體異常病例的NIPT結(jié)果及產(chǎn)前診斷情況

2.4 妊娠結(jié)局隨訪情況 有效隨訪538例，失訪42例，有效隨訪率91.2%，其中2例術(shù)后2周內(nèi)流產(chǎn)，流產(chǎn)率0.34%。產(chǎn)前診斷陽性病例中，所有21-三體、18-三體均終止妊娠；3例性染色體嵌合體、8例致病性或可能致病性CNVs孕婦選擇終止妊娠，1例(病例11)檢出致病性CNVs，提示可能導(dǎo)致“壓力敏感性周圍神經(jīng)病”，孕婦選擇繼續(xù)妊娠,截至發(fā)稿時(shí)，已足月剖宮產(chǎn)1子，新生兒無明顯異常。1例47,XYY, inv(9)(p12q13)分娩正常外觀男嬰；1例46,XN,idic(Y)(q11.2)失訪；8例染色體多態(tài)性及8例臨床意義不明CNVs繼續(xù)妊娠，病例隨訪至產(chǎn)后3個(gè)月均正常。

3 討論

3.1 唐篩高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體異常檢出率 唐篩因經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、無創(chuàng)等特點(diǎn)被廣大孕婦所接受，但研究表明唐篩高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體異常核型的檢出率僅3.8%～5.7%[2-5]。本研究590例唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，染色體核型異常者24例，檢出率為4.07%(24/590)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道一致。24例異常核型包括12例21-三體、5例18-三體、7例其他染色體異常，其他染色體異常的發(fā)生率為1.19%(7/590)，高于活產(chǎn)新生兒中染色體異常的發(fā)生率0.6%[6]，說明唐篩高風(fēng)險(xiǎn)除篩查21-三體和18-三體外，對(duì)其他染色體異常亦有一定提示作用。類似的觀點(diǎn)也見于其他學(xué)者[5，7]。

本研究所有病例除核型檢測(cè)外，均同時(shí)進(jìn)行了微陣列分析，核型或微陣列分析結(jié)果陽性者共54例，陽性率9.15%(54/590)，考慮本研究中的陽性結(jié)果包含了臨床意義不明CNVs和染色體雜合性缺失LOH，如果僅統(tǒng)計(jì)核型異常和微陣列致病性或可能致病性CNVs，則陽性率為5.59%(33/590)。核型正常而微陣列分析陽性者共30例(5.08%)，其中致病性CNVs和可能致病性CNVs共9例(1.52%)，與Shaffer等[8]報(bào)道的CMA在核型正常人群中可另外檢出1.7%有臨床意義的微缺失/重復(fù)的比例接近。為此，建議對(duì)行介入性產(chǎn)前診斷的唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦告知其染色體核型的檢出率及CMA的額外檢出率，在經(jīng)濟(jì)條件許可下聯(lián)合兩種檢測(cè)技術(shù)，增加染色體異常的檢出率。

3.2 唐篩高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的NIPT檢測(cè)情況 唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦需要進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷，存在一定的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，而唐篩高風(fēng)險(xiǎn)胎兒異常核型的檢出率不高，則意味著唐氏兒的檢出伴隨著一部分正常胎兒的丟失。NIPT檢測(cè)是近年來用于唐篩的新技術(shù)，通過抽取孕婦外周血檢測(cè)胎兒游離DNA片段，對(duì)胎兒常見非整倍體進(jìn)行篩查，唐氏綜合征檢出率高達(dá)99%[9]，隨著測(cè)序成本的降低，NIPT檢測(cè)費(fèi)用下降，深圳市已將其納入生育險(xiǎn)項(xiàng)目，免費(fèi)提供NIPT檢測(cè)，深受廣大孕婦青睞。

研究表明，NIPT檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值分別為21-三體92%～93%、18-三體75%～92%、13-三體36%～49%、性染色體異常48%～59%、其他染色體異常9%～11%[10-12]。本研究54例染色體異常病例中有25例術(shù)前已行NIPT檢測(cè)，5例21-三體NIPT均提示高風(fēng)險(xiǎn)，2例18-三體NIPT檢出1例，1例18-三體NIPT提示檢測(cè)失敗，NIPT檢測(cè)失敗病例cffDNA含量?jī)H2.6%，重復(fù)采血后cffDNA含量仍低于4%，后經(jīng)羊水檢測(cè)證實(shí)為18-三體。cffDNA濃度低導(dǎo)致NIPT檢測(cè)失敗，考慮為相對(duì)大量的母體正常整倍體DNA影響到異常胎兒的DNA而無法給出檢測(cè)結(jié)果。李佳欣等[13]發(fā)現(xiàn)因cffDNA含量低導(dǎo)致NIPT檢測(cè)失敗的人群胎兒常見非整體的風(fēng)險(xiǎn)更高，2015年美國(guó)ACOG指南亦指出NIPT檢測(cè)失敗時(shí)胎兒非整倍體風(fēng)險(xiǎn)增加，應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步遺傳咨詢，并進(jìn)行全面超聲評(píng)估和產(chǎn)前診斷[14]。本研究中7例非整倍體均未漏診，提示NIPT對(duì)常見非整倍體的篩查效率高，對(duì)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例實(shí)施侵入性產(chǎn)前診斷，有的放矢，可減少不必要的侵入性產(chǎn)前診斷，減少胎兒丟失。同時(shí)提醒我們臨床醫(yī)生需警惕NIPT檢測(cè)失敗病例的處理。

本研究中18例其他染色體異常病例，NIPT提示其他染色體異常的有7例，包括4例致病性或可能致病性CNVs；3例臨床意義不明CNVs或LOH。另外11例NIPT均提示低風(fēng)險(xiǎn)，其中7例為臨床意義不明CNVs或LOH病例。值得注意的是，有4例NIPT低風(fēng)險(xiǎn)病例檢出致病性CNVs，具體如下：病例8核型為MOS47,XXX[27]/45,X[22]，孕19周終止妊娠前超聲未見明顯異常?？紤]胎兒為性染色體嵌合體，主要與性發(fā)育異常相關(guān)，且超聲篩查時(shí)孕周偏小，不排除后期Ⅲ級(jí)系統(tǒng)超聲篩查檢出異?？赡堋２±?檢出在X染色體Xp22.31發(fā)生半合子缺失，該區(qū)城半合子缺失可致“X連鎖魚鱗病”，超聲未見異常，已告知孕婦該病預(yù)后較好，孕婦因社會(huì)因素終止妊娠。病例10為44歲高齡孕婦，錯(cuò)過NT篩查，因血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)，先在外院行NIPT提示低風(fēng)險(xiǎn)，至我產(chǎn)前診斷中心了解到NIPT的局限性后，行羊水檢測(cè)，檢出18p-綜合征，孕22周終止妊娠，拒絕引產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)篩查及引產(chǎn)后尸解，故無法得知胎兒是否有畸形。病例11孕期NT 2.8 mm(>95 th)，Ⅲ級(jí)超聲提示胎兒三尖瓣輕度反流。檢出致病性CNVs，提示可能導(dǎo)致“壓力敏感性周圍神經(jīng)病”，孕婦已咨詢神經(jīng)科醫(yī)生，該病以反復(fù)的周圍神經(jīng)受壓后麻痹,大部分可完全恢復(fù)為主要特征，孕婦選擇繼續(xù)妊娠,截至發(fā)稿時(shí)，已足月剖宮產(chǎn)1子，新生兒無明顯異常。以上病例的致病性CNVs影響的分別為性發(fā)育、皮膚病、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病，故即便是NIPT聯(lián)合超聲篩查也可能漏診。 病例8和9唯一的產(chǎn)前診斷指征為唐篩高風(fēng)險(xiǎn)，楊樹法等[15]也發(fā)現(xiàn)接受NIPT檢測(cè)的唐篩高風(fēng)險(xiǎn)孕婦存在潛在的染色體畸形漏診風(fēng)險(xiǎn)。目前深圳市孕婦可接受免費(fèi)的NIPT檢測(cè)，部分孕婦摒棄血清學(xué)唐篩直接進(jìn)行NIPT檢測(cè)，因NIPT僅檢測(cè)21、18、13號(hào)染色體的數(shù)目異常，這可能會(huì)導(dǎo)致漏診部分染色體異常病例。另外，唐篩高風(fēng)險(xiǎn)提示的LOH,也是NIPT無法檢測(cè)的，而涉及6、7、11、14、15、20等含有印記基因的染色體如發(fā)生雜合性缺失則有重要的臨床意義。

綜上所述，血清學(xué)唐篩高風(fēng)險(xiǎn)除了提示21-三體和18-三體綜合征外，可提示其他染色體異常，NIPT有可能檢出其他染色體異常，但仍會(huì)漏診部分致病性CNVs及LOH，介入性產(chǎn)前診斷檢測(cè)胎兒CS及CMA仍是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。不提倡摒棄血清學(xué)唐篩直接進(jìn)行NIPT檢測(cè)的做法，對(duì)于同時(shí)進(jìn)行以上2種檢測(cè)，出現(xiàn)唐篩高風(fēng)險(xiǎn)，NIPT低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦做好遺傳咨詢，充分告知介入性產(chǎn)前診斷的意義及風(fēng)險(xiǎn)、NIPT檢測(cè)的局限性，由其權(quán)衡利弊后作出符合自身?xiàng)l件的決定。