宋翠薇， 艾麗梅

1錦州醫(yī)科大學(xué)撫順市中心醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地(遼寧撫順 113006)； 2錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科(遼寧錦州 121000)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞惡性增殖性疾病，發(fā)病占血液系統(tǒng)腫瘤的第2位，僅次于非霍奇金淋巴瘤，約占13%[1]。隨著對(duì)其生物學(xué)、病理學(xué)和新的治療方案的研究，患者的生存率和生活質(zhì)量得到了顯著提高。盡管對(duì)MM的研究取得了新進(jìn)展，目前其仍是一種不可治愈的疾病[2]。微小RNA(microRNAs)是一類小非編碼RNA，在包括腫瘤在內(nèi)的人類代謝疾病中發(fā)揮重要作用[3]，因其在參與調(diào)節(jié)漿細(xì)胞發(fā)育和骨髓瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用而受到關(guān)注[4]，成為近幾年研究熱點(diǎn)。miRNAs作為致癌調(diào)節(jié)劑或腫瘤抑制劑，可能是癌癥發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因子，miRNAs去調(diào)控與包括MM在內(nèi)的幾種惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5-6]。腫瘤抑制基因miRNAs通常在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)和(或)缺失，它們的靶點(diǎn)是參與腫瘤細(xì)胞增殖和存活機(jī)制的mRNA。相反，發(fā)揮致癌作用的miRNAs在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，并通過靶向腫瘤抑制基因促進(jìn)腫瘤發(fā)展，因此，取代下調(diào)的miRNAs或抑制過度表達(dá)的miRNAs可能是基于miRNAs癌癥治療的基本原理[5，7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p位于染色體17p13.1，在MM中其可能通hedgehog通路發(fā)揮作用，miR-324-5p在MM細(xì)胞中可能通過SCFβ- TrCPE3 連接酶抑制MM細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，發(fā)揮抑癌基因的作用[9-10]。 miR-215-5p在MM中通過靶向RUNX1基因，抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活而發(fā)揮抑癌基因的作用[11]。這兩種miRNAs在MM中研究較少，在MM患者血清中表達(dá)鮮見研究。因此本研究通過檢測MM患者血清miR-324-5p及miR-215-5p的表達(dá)水平，研究其表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年10月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科的未進(jìn)行造血干細(xì)胞移植的MM患者60例，年齡39～79歲，中位年齡62歲，門診健康人20例(健康對(duì)照組)。多發(fā)性骨髓瘤患者為3組實(shí)驗(yàn)組：初治MM患者20例(初治組)，鞏固治療MM患者20例(鞏固治療組)和復(fù)發(fā)難治的MM患者20例(復(fù)發(fā)難治組)；其中鞏固治療組為療效評(píng)估達(dá)部分緩解(PR)及以上的MM患者，包括完全緩解(CR)、非常好的部分緩解(VGPR)和部分緩解(PR)，難治復(fù)發(fā)組為經(jīng)6個(gè)周期化療后未達(dá)到PR的MM患者，包括疾病穩(wěn)定(SD)、疾病進(jìn)展(PD)和微小緩解(MR)。所有病例符合MM診斷標(biāo)準(zhǔn)， 并排除自身免疫性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、各種急慢性感染性疾病、其他惡性腫瘤等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清樣本收集 收集各受檢者空腹靜脈血3 mL于帶有分離膠的真空采集管中，室溫下，3 500 r/min離心5 min，離心后將上層血清分裝于無RNA酶的1.5 mL EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清miRNA提取、反轉(zhuǎn)錄和定量 取200 μL血清用于miRNA提取(按照天根生化科技公司miRcute血清提取分離試劑盒說明書進(jìn)行操作)；按照說明書操作步驟，取8 μL總RNA進(jìn)行miRNA cDNA第一鏈合成；以U6為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測血清中miR-324-5p、miR-215-5p的表達(dá)水平(試劑盒和引物購于天根生化科技公司，操作步驟參照說明書)。根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線判斷反應(yīng)質(zhì)量，以2-ΔΔCt代表目的基因miRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

1.2.3 臨床指標(biāo)收集 收集患者和健康人入院時(shí)的臨床指標(biāo)，包括血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)、血小板計(jì)數(shù)(Plt)、β2微球蛋白(β2-MG)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酐。各臨床指標(biāo)均由經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)醫(yī)師對(duì)各受檢者空腹靜脈血進(jìn)行檢測獲得。

1.3 生存分析 對(duì)20例初治MM患者進(jìn)行生存分析，由于時(shí)間限制，選取無進(jìn)展生存期(PFS)作為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行分析，隨訪時(shí)間截止到2019年11月30日，其中疾病進(jìn)展的患者有7例。以中位數(shù)為節(jié)點(diǎn)，將MM患者血清miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平高于中位數(shù)組定義為高表達(dá)組，低于中位數(shù)組定義為低表達(dá)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間的檢驗(yàn)先采用單因素方差分析，服從方差齊性的多組間數(shù)據(jù)若整體存在差異，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；不服從方差齊性的多組數(shù)據(jù)間的檢驗(yàn)采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni校正進(jìn)行比較， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.008 3。運(yùn)用Pearson相關(guān)比較兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性，運(yùn)用GraphPad Prism 5分析生存曲線，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平 各組患者和健康對(duì)照組miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=23.77，52.47，P<0.001)。與健康對(duì)照組比較，各組MM患者血清中miR-215-5p表達(dá)水平下降(P<0.008 3)，初治組和難治復(fù)發(fā)組患者血清miR-324-5p表達(dá)水平下降(P<0.008 3)，鞏固治療組與健康對(duì)照組血清miR-324-5p表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)；各組患者間比較，鞏固治療組miR-324-5p表達(dá)水平高于初治組及難治復(fù)發(fā)組(P<0.008 3)；鞏固治療組血清miR-215-5p表達(dá)水平高于初治組(P<0.008 3)，鞏固治療組和難治復(fù)發(fā)組血清miR-215-5p表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)，初治組與復(fù)發(fā)難治組患者之間兩種miRNAs表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)。見表1。

表1 各組血清miR-324-5p和miR-215-5p相對(duì)表達(dá)量

2.2 各組臨床指標(biāo)分析

2.2.1 Hb分析 健康對(duì)照組Hb水平高于初治組和難治復(fù)發(fā)組(P<0.008 3)，與鞏固治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)；鞏固治療組血紅蛋白水平高于難治復(fù)發(fā)組(P<0.008 3)，初治組與復(fù)發(fā)難治組和鞏固治療組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)。見表2。

2.2.2 RDW分析 健康對(duì)照組RDW水平低于各組MM患者(P<0.008 3)，各組MM患者之間RDW差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)。見表2。

2.2.3 Plt水平分析 健康對(duì)照組Plt水平高于鞏固治療組(P<0.05)，與初治組和難治復(fù)發(fā)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；鞏固治療組Plt水平低于初治組(P<0.05)，難治復(fù)發(fā)組與鞏固治療組和初治組之間Plt水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2.4 β2-MG水平分析 健康對(duì)照組β2-MG水平低于各組MM患者(P<0.008 3)；各組MM患者之間β2-MG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)。見表2。

2.2.5 LDH水平分析 4組之間LDH表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.525，P=0.215)。

2.2.6 肌酐水平分析 健康對(duì)照組肌酐水平低于初治組和復(fù)發(fā)難治組(P<0.008 3)，與鞏固治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)；各組患者間肌酐水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.008 3)。見表2。

表2 各組的臨床指標(biāo)

2.3 miR-324-5p、miR-215-5p與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 miR-324-5p表達(dá)水平與β2-MG呈負(fù)相關(guān)(r=-0.571，P<0.001)；與Hb呈正相關(guān)(r=0.465，P<0.001)；與RDW呈負(fù)相關(guān)(r=-0.367，P<0.001)。miR-215-5p表達(dá)水平與β2-MG呈負(fù)相關(guān)(r=-0.505，P<0.001)；與Hb呈正相關(guān)(r=0.559，P<0.001)；與RDW呈負(fù)相關(guān)(r=-0.392，P<0.001)。血清miR-324-5p、miR-215-5p表達(dá)水平與血小板計(jì)數(shù)、LDH、肌酐無相關(guān)性，見圖1～6。

圖1 血清miR-324-5p與β2-MG相關(guān)性 圖2 血清miR-215-5p與β2-MG相關(guān)性 圖3 血清miR-324-5p與血紅蛋白相關(guān)性

圖4 血清miR-215-5p與血紅蛋白相關(guān)性 圖5 血清 miR-324-5p與RDW相關(guān)性 圖6 血清miR-215-5p與RDW相關(guān)性

2.4 miR-324-5p和miR-215-5p與MM預(yù)后分析

2.4.1 血清miR-324-5p表達(dá)水平與MM預(yù)后分析 初治組患者血清miR-324-5p表達(dá)水平中位數(shù)0.347，以中位數(shù)為界限劃分，高表達(dá)組10例，低表達(dá)組10例。高表達(dá)組和低表達(dá)組PFS存在差異，高表達(dá)組PFS高于低表達(dá)組(P=0.031)，見圖7。

圖7 初治MM患者不同miR-324-5p表達(dá)水平 PFS 分析

2.4.2 血清miR-215-5p表達(dá)水平與MM預(yù)后分析 初治組患者血清miR-215-5p相對(duì)表達(dá)水平中位數(shù)為0.402，以中位數(shù)為界限劃分，其中高表達(dá)組10例，低表達(dá)組例10例。兩組之間PFS存在差異，高表達(dá)組PFS較低表達(dá)組延長(P=0.009)，見圖8。

圖8 初治MM患者不同miR-215-5p表達(dá)水平PFS 分析

3 討論

微小RNAs(microRNAs)是一類小的非編碼RNA，約由22個(gè)核苷酸組成，通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)以互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合[12]，導(dǎo)致靶基因降解或翻譯被抑制，從而對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控。miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)約30%的基因，因此與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13]。研究表明，miRNAs可能與體外調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖、分化、代謝、侵襲和遷移有關(guān)[14-15]。在過去幾年中，一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn) miRNAs作為MM的預(yù)后和診斷生物標(biāo)志物的潛在作用[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，血漿、血清、唾液和尿液等各種體液存在miRNAs的表達(dá)，并且作為一種侵入性小的標(biāo)記物引起注意[18]。有研究對(duì)MM血清中miRNAs表達(dá)進(jìn)行分析，在新診斷的MM患者中發(fā)現(xiàn)了95個(gè)表達(dá)失調(diào)的miRNAs。研究發(fā)現(xiàn)miR-19a和miR-4254聯(lián)合檢測可以區(qū)分MM和健康人；而且miR-19a低表達(dá)與國際分期系統(tǒng)(ISS分期)進(jìn)展、del(13q14)和1q21擴(kuò)增呈正相關(guān)，而分期和基因缺失、擴(kuò)增與疾病的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)。此外，血清miR-19a的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致患者的PFS和總生存率(OS)顯著降低，血清miR-19a低表達(dá)提示預(yù)后不良[17]。由此可見，miRNAs在MM診斷、預(yù)后判斷中具有指導(dǎo)意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p在骨髓瘤漿細(xì)胞和人骨髓瘤細(xì)胞株中表達(dá)水平下降，并且隨著危險(xiǎn)分級(jí)的增加，其表達(dá)水平會(huì)下降，體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p會(huì)抑制MM細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其在MM中可能發(fā)揮了抑癌基因的作用[9-10]。miR-215-5p在MM漿細(xì)胞和人骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-215-5p抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，在MM中發(fā)揮抑癌基因的作用[11]。這兩種miRNAs在MM中發(fā)揮了抑癌基因的作用，但在血清中表達(dá)水平尚未研究，基于此內(nèi)容，本研究選取血清樣本，檢測血清中兩種miRNAs表達(dá)水平，創(chuàng)傷性較小，易于操作。

為了確定MM血清中miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平，分析其表達(dá)與MM預(yù)后的關(guān)系，本研究選取不同疾病狀態(tài)的MM患者檢測血清中兩種miRNAs表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，miR-215-5p在各組MM中表達(dá)水平降低，miR-324-5p表達(dá)水平在鞏固治療組和健康對(duì)照組之間無明顯差異，在初治組和難治復(fù)發(fā)組患者中表達(dá)水平下降。鞏固治療組miR-324-5p表達(dá)水平高于初治組和難治復(fù)發(fā)組，鞏固治療組血清miR-215-5p表達(dá)水平高于初治組，這表明不同疾病病理狀態(tài)，miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平可能不同，其表達(dá)水平失調(diào)可能與疾病密切相關(guān)。MM患者預(yù)后與ISS分期、R-ISS分期、LDH、異常基因等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種miRNAs表達(dá)水平與β2-MG呈負(fù)相關(guān)，β2-MG反映腫瘤負(fù)荷，且與ISS分期密切相關(guān)，提示這兩種miRNAs在一定程度上可以反映腫瘤負(fù)荷，ISS分期越晚，其表達(dá)水平可能越低。有研究發(fā)現(xiàn)，RDW表達(dá)水平升高提示預(yù)后不良，在一定程度上可以幫助判斷患者預(yù)后[19]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，患者RDW水平高于健康對(duì)照組，而且miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平與RDW存在負(fù)相關(guān)，這提示miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平可以幫助判斷疾病預(yù)后。通過對(duì)初治MM患者選取無進(jìn)展生存期進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p和miR-215-5p不同的表達(dá)水平PFS存在差異，miR-324-5p和miR-215-5p高表達(dá)組PFS較低表達(dá)組延長，推斷miR-324-5p和miR-215-5p表達(dá)水平和MM預(yù)后存在關(guān)系，其低表達(dá)可能是預(yù)后不良的指標(biāo)。本研究檢測miR-324-5p表達(dá)水平在MM患者血清中表達(dá)水平降低，這與之前研究其在人骨髓瘤細(xì)胞及骨髓液中表達(dá)水平一致[9-10]。miR-215-5p表達(dá)水平在MM患者血清中降低，這與人骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤漿細(xì)胞表達(dá)不一致[11]，可能是因?yàn)轶w內(nèi)細(xì)胞信號(hào)通路作用導(dǎo)致。有研究發(fā)現(xiàn)血清中miRNAs表達(dá)水平和細(xì)胞、骨髓液中表達(dá)不一致[16-17]。有待大量臨床樣本檢測患者血清中兩種miRNAs表達(dá)水平進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，miR-324-5p和miR-215-5p可能在MM中發(fā)揮重要作用，血清miRNAs有望成為MM診斷、預(yù)后判斷的侵襲性小的潛在生物標(biāo)志物。未來檢測其作用通路及靶點(diǎn)，選取大樣本進(jìn)行研究會(huì)更具有代表性，并對(duì)PFS和OS進(jìn)行分析可以為MM治療和預(yù)后提供更好的方向。