成俊芬, 戴彩同, 吳格怡, 黎雄斌, 林永聯(lián), 梁一波, 陳鳴娣

湛江市第二人民醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科， 3科教科, 4重癥監(jiān)護(hù)室(廣東湛江 524000)； 2廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院(廣東湛江 524000)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)是臨床上常見(jiàn)的一種睡眠呼吸障礙性疾病，男性成人患病率為3%～7%，女性為2%～5%[1]。其主要特點(diǎn)是夜間睡眠時(shí)頻繁的呼吸暫停和通氣不足，導(dǎo)致頻發(fā)血氧飽和度下降，突出的臨床表現(xiàn)是睡眠打鼾伴反復(fù)憋醒，白天精神不振伴嗜睡等，是一種發(fā)病率高并可嚴(yán)重影響生活并危及生命的疾病。中華醫(yī)學(xué)會(huì)睡眠呼吸障礙學(xué)組已在2011版中的阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征的診治指南[2]中提出：OSAS 或可引起或加重多臟器、多系統(tǒng)疾病的發(fā)展，如高血壓、冠心病、心律失常、2型糖尿病、腦血栓、腦出血、癡呆癥、精神異常、遺尿、腎功能損害等。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs) 是近年研究的一個(gè)熱點(diǎn)，它是蛋白質(zhì)和脂類與還原糖在非酶糖基化后生成的多種不同物質(zhì)的統(tǒng)稱。研究[3]發(fā)現(xiàn)，衰老、高血糖、腎功能衰竭、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)等因素可促進(jìn)AGEs的形成。近年來(lái)陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，在OSAS患者體內(nèi)亦存在有AGEs水平升高的現(xiàn)象[4]，但在OSAS患者中血清AGEs的增加是否與OSAS的高心血管風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)仍有待研究。紅景天是多年生草本植物，常生長(zhǎng)在高原地區(qū)，其全草均可入藥，在其基礎(chǔ)上提取的大株紅景天注射液現(xiàn)已在臨床上被廣泛應(yīng)用，具有活血化瘀、清熱解毒等功效。梁光彬等[5]在研究觀察60例應(yīng)用紅景天膠囊治療OSAS患者，發(fā)現(xiàn)患者心功能指標(biāo)、睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)以及肥胖指數(shù)等均有不同程度的改善，提示紅景天膠囊可以改善OSAS患者的心功能，但通過(guò)何種機(jī)制改善癥狀則國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。2015年7月至2017年12月本研究將通過(guò)建立慢性間歇低氧小鼠模型模擬人體OSAS疾病，探討AGEs-糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced glycosylation end product-specific receptor,RAGE)/ 核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路與OSAS多臟器損害的關(guān)系，為OSAS及其并發(fā)癥的防治提供更多的方向。在上述研究的同時(shí)，進(jìn)一步了解大株紅景天對(duì)OSAS臟器的作用并探討其中的機(jī)制，為其在臨床上用于治療OSAS多臟器損害提供更多可靠的依據(jù)，亦能為我國(guó)中醫(yī)藥在臨床上的應(yīng)用提供更多的經(jīng)驗(yàn)及循證依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)大株紅景天的臨床應(yīng)用前景及弘揚(yáng)我國(guó)優(yōu)秀的中醫(yī)藥文化有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 清潔級(jí)BALB/c小鼠53只，雄性，體重(18±2)g，購(gòu)買于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK(粵)2013-0002]。小鼠IL-6 ELISA 試劑盒、小鼠AGEs ELISA 試劑盒和小鼠TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)于北京誠(chéng)林生物科技有限公司；兔抗小鼠 RAGE 抗體購(gòu)于美國(guó) SANTACRUZ 公司；兔抗小鼠 NF-κB 抗體購(gòu)于美國(guó) SIGMA 公司；兔抗小鼠β-actin 抗體購(gòu)于美國(guó)SANTACRUZ 公司。

1.2 動(dòng)物建模與分組 將53只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(對(duì)照組)15只和間歇低氧模型組(模型組)38只。對(duì)照組小鼠在普通環(huán)境下常規(guī)喂養(yǎng)，模型組小鼠放置于間歇低氧艙內(nèi)(圖1)，每天間歇低氧 8 h，共 6 周，建立慢性間歇性低氧小鼠模型以模擬人體OSAS。

圖1 間歇低氧艙示意圖

增加N2使O2含量降低，以低氧-再氧合為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)總時(shí)間為8 min，首先向低氧艙內(nèi)輸入濃度為99%的氮?dú)?約60 s)，艙內(nèi)氧濃度逐漸降至8.5%，在此濃度維持240 s后，通過(guò)排除N2和輸入空氣(約60 s)使動(dòng)物艙內(nèi)O2濃度逐漸升至21%，并持續(xù)120 s。實(shí)驗(yàn)周期為6周，每周7 d，每天間歇低氧時(shí)間為8 h(09:00～17:00)。

第6周時(shí)隨機(jī)選取模型組及對(duì)照組小鼠各5只，抽取心臟動(dòng)脈血行血?dú)夥治鰴z測(cè)造模是否成功。造模成功后，將模型組隨機(jī)分A、B、C三組各11只，B組終止間歇低氧條件，恢復(fù)普通環(huán)境喂養(yǎng)，模擬改善通氣治療4周，A及C組繼續(xù)予每天8 h間歇低氧，在上述條件下，C組小鼠每天予腹腔注射治療量大株紅景天注射液[劑量：52 mg/(kg·d) ]4周，B、C組及對(duì)照組同時(shí)予同體積的生理鹽水腹腔注射4周。即造模成功后，將模型組隨機(jī)分為3組：A組(間歇低氧+生理鹽水)、B組(復(fù)氧+生理鹽水)、C組(間歇低氧+大株紅景天)。對(duì)照組及A、B、C各組在各自不同條件下繼續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.3 取材與檢測(cè)方法

1.3.1 取材 各組均于10周后處死，麻醉小鼠后抽取血液置于EP管內(nèi)，4℃冰箱內(nèi)靜置4 h后離心10 min，提取上清液于-80℃保存，待用ELISA方法檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及AGEs水平。同時(shí)，心臟采血后立即予斷頭處死，解剖小鼠大腦、心臟組織，將部分小鼠心臟組織及左側(cè)大腦置于液氮中迅速凍存，待用Western Blot檢測(cè)RAGE、NF-κB蛋白的表達(dá)；取小鼠右側(cè)大腦及剩余心臟組織浸泡于10%中性甲醛溶液固定，待行病理組織HE染色。

1.3.2 ELISA 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在待測(cè)樣品孔中加入樣品稀釋液40 μL，再加待測(cè)樣品10 μL，用封板膜封板后置于恒溫箱內(nèi)反應(yīng)1 h，洗板，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，封膜后再溫育1 h，反應(yīng)，顯色后加入終止液，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品IL-6、TNF-α、AGEs的含量。

1.3.3 Western blot 將-80℃取出的組織解凍、去除殘余血液，用液氮將其研磨成粉末，加入適量含PMSF的細(xì)胞裂解液，離心后提取出組織蛋白。用BCA法蛋白測(cè)定，計(jì)算出各樣品蛋白的實(shí)際濃度。 配置10%分離膠及5%濃縮膠，插上梳子，制成SDS-PDGE凝膠，加入1×電泳緩沖液，將處理好的蛋白和MARK依序加樣，恒壓80 V電泳30 min，將樣品壓成窄帶后調(diào)整為120 V電泳90 min，轉(zhuǎn)膜，洗膜、封閉，剪下目的蛋白及內(nèi)參條帶置于稀釋后的一抗中(RAGE抗體：1∶500；NF-κB抗體：1∶500；β-actin抗體：1∶1 000)4℃搖床孵育過(guò)夜，復(fù)溫，洗膜，將膜放置于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗中(1∶1 000)室溫下慢搖孵育1 h，洗膜，配置ECL發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.3.4 HE病理學(xué)檢查 將浸泡在10%中性甲醛溶液中的組織制成石蠟切片，厚度為4 μm。經(jīng)脫蠟、水化、蘇木精染色、分化水液、氨水返藍(lán)、伊紅復(fù)染、脫水、透明、封皮后，置于光學(xué)顯微鏡中觀察各組心臟組織及大腦組織的病理變化。

2 結(jié)果

2.1 慢性間歇低氧小鼠造模情況 因抽取小鼠左心室動(dòng)脈血操作較精細(xì)，小鼠耐受性亦較低，容易在操作過(guò)程中死亡，在隨機(jī)抽取的對(duì)照組及模型組各5只小鼠中，有2只對(duì)照組小鼠及1只模型組小鼠在操作過(guò)程中死亡，未能抽及動(dòng)脈血，而在剩余的小鼠中，其動(dòng)脈血?dú)夥治鎏崾?，模型組小鼠動(dòng)脈血氧飽和度較對(duì)照組小鼠明顯降低，說(shuō)明慢性間歇低氧小鼠的模型是成功的。見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組與模型組小鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果

2.2 各組小鼠中血清AGEs水平的表達(dá)情況 對(duì)照組小鼠血清AGEs水平為(432.7±92.99) ng/L，而A組為(527.5±97.53) ng/L，可見(jiàn)與對(duì)照組相比，A組小鼠血清AGEs水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031 7)；而C組及B組的小鼠血清AGEs水平分別為(524.4±69.73)ng/L和(481.7±63.43)ng/L，與A組的相比，均有下降的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，C組仍明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044 8)。見(jiàn)圖2。

注：*與對(duì)照組比較P<0.05圖2 各組小鼠血清AGEs水平的比較

2.3 各組小鼠中血清IL-6水平的表達(dá)情況 A組小鼠血清IL-6水平為(110.3±15.10)pg/mL，較對(duì)照組小鼠的(84.85±17.41)pg/mL比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 7)；B組及C組小鼠的血清IL-6水平分別為(101.8±17.35) pg/mL和(92.43±19.04) pg/mL，均較對(duì)照組升高，但僅B組小鼠與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037 8)；而與A組相比，C組血清IL-6水平有所降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032 8)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；△與A組相比P<0.05圖3 各組小鼠血清IL-6水平的比較

2.4 小鼠血清TNF-α水平的表達(dá) 對(duì)照組小鼠血清TNF-α水平為(445.8±89.50) ng/L，A組小鼠為(584.5±76.36) ng/L，A組較對(duì)照組小鼠明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002 8)；B組及C組小鼠血清TNF-α水平分別為(484.1±118.4)ng/L和(502.8±100.0)ng/L，均較A組明顯下降，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041 7、0.048 8)。見(jiàn)圖4。

注：*與對(duì)照組比較P<0.01；△與A組比較P<0.05圖4 各組小鼠血清TNF-α水平的比較

2.5 心臟組織HE染色 對(duì)照組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)清晰完整、界限清楚、排列緊密；而A組小鼠心肌組織排列紊亂，結(jié)構(gòu)、紋理不清，部分肌細(xì)胞核固縮深染。B組小鼠心肌結(jié)構(gòu)較A組清晰，核固縮深染現(xiàn)象較A組減少，而C組小鼠心肌結(jié)構(gòu)較清楚，排列亦較緊密。見(jiàn)圖5。

注：A：對(duì)照組；B：A組；C：B組；D：C組圖5 心臟組織HE染色圖片(400×)

2.6 大腦組織HE染色 正常對(duì)照組小鼠腦組織細(xì)胞數(shù)量較多，胞質(zhì)均質(zhì)紅染，核大且圓，核仁清晰，血管較多且粗大，神經(jīng)纖維縱橫交錯(cuò)致密；A組腦組織細(xì)胞數(shù)量減少較明顯，排列紊亂、稀疏，部分細(xì)胞核固縮深染，呈紫藍(lán)色梭形，絕大多數(shù)細(xì)胞有核仁碎裂現(xiàn)象，血管較少且細(xì)，神經(jīng)纖維較對(duì)照組稀疏。B組及C組腦組織細(xì)胞較A組有所增多，排列較A組緊密，核固縮深染現(xiàn)象較A組有所減輕。而與B組相比，C組的神經(jīng)纖維排列更緊密，余形態(tài)變化差別不明顯。 見(jiàn)圖6。

注：A：對(duì)照組；B：A組；C：B組；D：C組圖6 大腦組織HE染色圖片(400×)

2.7 RAGE及NF-κB蛋白在小鼠心臟組織中的表達(dá) 對(duì)照組小鼠心臟組織中RAGE及NF-κB的表達(dá)最弱，A組小鼠的NF-κB的表達(dá)在各組中表達(dá)最強(qiáng)，其RAGE蛋白表達(dá)比對(duì)照組及B組強(qiáng)，而與C組相仿；C組小鼠RAGE及NF-κB均較對(duì)照組及B組表達(dá)增多。見(jiàn)表2和圖7、8。

對(duì)照組中小鼠心臟組織中RAGE及NF-κB在各組的表達(dá)中是最弱的，A組小鼠心臟組織中的RAGE及NF-κB蛋白均表達(dá)最強(qiáng)，比對(duì)照組明顯增多，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而A組與B組、C組相比，其表達(dá)則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組的RAGE及NF-κB的表達(dá)均較B組有所增多，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和圖7、8。

表2 歸一化處理后的各組小鼠心臟組織RAGE及NF-κB蛋白灰度值

圖7 RAGE及NF-κB在各組小鼠心臟組織的表達(dá)情況

注：A：RAGE；B：NF-κB；*P<0.05圖8 RAGE及NF-κB蛋白在各組小鼠心臟組織中表達(dá)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.8 RAGE及NF-κB蛋白在小鼠大腦組織中的表達(dá) 在各組小鼠的大腦組織中，對(duì)照組小鼠RAGE及NF-κB的表達(dá)均較少，而A組的RAGE及NF-κB蛋白的表達(dá)則最強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PRAGE<0.05，PNF-κB<0.01)；與A組相比，C組的RAGE表達(dá)稍有減少，而NF-κB的表達(dá)則較其有更為明顯的下降(P<0.05)。C組與B組相比，兩種蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3和圖9、10。

表3 歸一化處理后的各組小鼠大腦組織中RAGE及NF-κB蛋白灰度值

圖9 RAGE及NF-κB在各組小鼠大腦組織中的表達(dá)情況

注：A：RAGE；B：NF-κB；*P<0.05；**P<0.01圖10 各組小鼠大腦組織中RAGE及NF-κB蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

3.1 小鼠間歇缺氧模型的建立 OSAS動(dòng)物模型的構(gòu)建中，主要以嚙齒類動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[6]，如大鼠、小鼠等小動(dòng)物常用于構(gòu)建低氧模型，犬、豬、兔、貓、猴等較大型動(dòng)物亦常被用于OSAS的造模，但主要是通過(guò)一定程度地阻塞上氣道來(lái)模擬OSAS患者形態(tài)學(xué)上的改變，但因這些動(dòng)物體型較大，費(fèi)用較昂貴，難以形成規(guī)模性的研究。OSAS最根本的病理生理特點(diǎn)是長(zhǎng)期的慢性間歇性低氧，因此，在以往的研究中，有國(guó)內(nèi)外學(xué)者[7]通過(guò)往復(fù)運(yùn)動(dòng)式低氧艙、低壓低氧艙、低O2高CO2箱等方法建立OSAS動(dòng)物模型，但都因?qū)嶒?yàn)設(shè)備要求高、操作復(fù)雜、重復(fù)性差、不能排除干擾因素及準(zhǔn)確反映常壓下缺氧的情況而逐漸被摒棄。目前建立OSAS動(dòng)物模型應(yīng)用最廣泛的方法是通過(guò)常壓混合氣體箱[8]，在常壓的狀態(tài)下，通過(guò)改變箱內(nèi)氣體各成分的濃度、比例來(lái)建立低氧環(huán)境。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求及目的，可調(diào)節(jié)箱內(nèi)低氧的程度及持續(xù)時(shí)間，現(xiàn)認(rèn)為最低氧濃度多控制為5%～10%[9-10]為佳，低氧-再氧合周期可從30 s～8 min不等。這種方法操作方便簡(jiǎn)捷，可控性強(qiáng)，重復(fù)性高，雖不能完全復(fù)制人體OSAS氣道狹窄的形態(tài)學(xué)改變，但能較好地復(fù)制OSAS患者缺氧-再氧合的病理生理變化。

3.2 慢性間歇缺氧小鼠心臟及大腦組織的病理變化 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比A組及對(duì)照組小鼠的心臟及大腦組織的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在心肌組織中，對(duì)照組小鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)完整清晰、界限清楚、排列緊密；而A組小鼠心肌組織排列紊亂，結(jié)構(gòu)、紋理不清，部分肌細(xì)胞核固縮深染。同樣地，在腦組織中，A組腦組織細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組小鼠明顯減少，且排列紊亂、稀疏，部分細(xì)胞核固縮深染，呈紫藍(lán)色梭形，絕大多數(shù)細(xì)胞有核仁碎裂現(xiàn)象，血管較少且細(xì)，神經(jīng)纖維較對(duì)照組稀疏。說(shuō)明了慢性間歇低氧可對(duì)大腦及心臟組織造成形態(tài)上的損害，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了OSAS患者可引起多臟器損傷及易并發(fā)多種慢性疾病的這一觀點(diǎn)，而這與OSAS的慢性間歇低氧導(dǎo)致的氧化應(yīng)激及炎癥改變等一系列的病理生理變化密切相關(guān)。

3.3 AGEs-RAGE/NF-κB途徑與慢性間歇低氧小鼠的關(guān)系

3.3.1 血清AGEs在慢性間歇低氧小鼠中的變化 AGEs是蛋白質(zhì)和脂類非酶糖基化反應(yīng)啟動(dòng)后的一系列化學(xué)反應(yīng)后所形成的一類化合物的總稱，本身不具有反應(yīng)活性，其主要包括有羧甲基賴氨酸(CML)、蛋白質(zhì)交聯(lián)后產(chǎn)物等。它在體內(nèi)中多從氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生，亦可通過(guò)外源性途徑(主要為飲食)獲得，其常積聚在組織中，并可隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[11]。AGEs在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著非常重要的作用，并且已有研究[12]發(fā)現(xiàn)，在OSAS患者體內(nèi)同樣有AGEs水平的升高，并且提出OASA本身可能是影響血清AGEs水平高低的因素之一。雖與糖尿病患者相比其增高水平不明顯，但OSAS患者血清中AGEs水平確實(shí)較正常增高，并且在使用CAPA治療后的患者AGEs較未治療前有所下降。國(guó)外研究證明AGEs的血清水平增高與睡眠呼吸障礙的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，予間歇低氧10周后的A組小鼠血清AGEs水平(527.5±97.53) ng/L，而正常對(duì)照組小鼠僅為(432.7±92.99) ng/L，可見(jiàn)A組的小鼠較對(duì)照組是明顯升高的，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這也證實(shí)了OSAS這種疾病是可促進(jìn)AGEs的產(chǎn)生的，與上述相關(guān)研究結(jié)果相符。原因可能是OSAS本質(zhì)是一種慢性間歇低氧性疾病，類似缺血/再灌注的損傷機(jī)制，產(chǎn)生一系列的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，而氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)等因素是可促進(jìn)AGEs形成的，因此可在OSAS患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)血清AGEs水平病理性的升高。

3.3.2 AGEs-RAGE/NF-κB途徑對(duì)慢性間歇低氧小鼠的影響 AGEs在不同的器官組織有不同的的致病機(jī)制，它的許多效應(yīng)大多是通過(guò)結(jié)合相關(guān)受體而實(shí)現(xiàn)，而晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)則是研究最多且與其親和性較高的一個(gè)受體，在AGEs介導(dǎo)的病變中起主要作用。RAGE是一種跨膜受體，亦是免疫球蛋白超家族的多配體受體中的一員，在體內(nèi)分布非常廣泛，在成年人體內(nèi)，RAGE主要分布在免疫細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和癌細(xì)胞中，但在正常人中，RAGE是低水平表達(dá)的，當(dāng)細(xì)胞或組織局部出現(xiàn)RAGE-配體或炎癥因子聚集時(shí)，可RAGE的表達(dá)將大大增加[14]。許多研究[15]表明，NF-κB的激活在RAGE-配體的致病機(jī)制中起著非常重要的作用。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體內(nèi)廣泛存在，在感染、炎癥反應(yīng)和DNA損傷等刺激下可對(duì)相關(guān)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。NF-κB以異源性或同源性二聚體形式存在于胞漿中，最常見(jiàn)的二聚體形式為P65和P50組成的異源性二聚體。一般情況下，NF-κB與抑制性蛋白IкB 結(jié)合而失去活性，而在受到毒素、氧自由基、缺氧、缺血、脂多糖以及白細(xì)胞介素等因素的刺激后，可與IкB 分離而重新獲得轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的能力，最終導(dǎo)致一系列炎癥因子及趨化因子如IL-6、TNF-α、GM-CSF等的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。AGEs與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的RAGE結(jié)合后，在體內(nèi)外均可引起NF-κB p65 mRNA和抗原表達(dá)增加，NF-κB持續(xù)活化，而NF-κB的活化，可引起大量促炎細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α等)、生長(zhǎng)因子和黏附因子等的表達(dá)和釋放，從而引起復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。RAGE作為AGEs在細(xì)胞表面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，可激活細(xì)胞內(nèi)部各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，如磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、P38 MAPK、MAPK/Erk1,2、JNK/SAPK、rho-GTP酶及JAK/STAT等信號(hào)途徑，大多通過(guò)活化NF-κB這個(gè)具多項(xiàng)調(diào)節(jié)功能的樞紐放大或級(jí)聯(lián)一系列炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成損害。因此，AGEs-RAGE/NF-κB通路是RAGE與AGEs相互作用后具有代表性的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[16]。近年來(lái)已在OSAS患者的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)AGEs水平較正常健康人是升高的，相關(guān)研究[17]發(fā)現(xiàn)，間歇缺氧可導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子的顯著上調(diào)。OSAS患者的慢性間斷性低氧血癥可引起血清中IL-6、CRP等水平增高，刺激循環(huán)中可溶性黏附分子如ICAM-1、VCAM-1表達(dá)增加[18]。因此可推測(cè)AGEs-RAGE/NF-κB信號(hào)通路在OSAS患者體內(nèi)是存在的，且對(duì)其起著一定的損害作用。

本實(shí)驗(yàn)取各組小鼠心臟及大腦組織檢測(cè)其RAGE及NF-κB蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：在小鼠心臟組織中，對(duì)照組小鼠RAGE及NF-κB的表達(dá)最弱，而A組的RAGE及NF-κB的表達(dá)在各組中表達(dá)最強(qiáng)；在小鼠的大腦組織中，A組的RAGE及NF-κB蛋白的表達(dá)在各組小鼠的仍是最強(qiáng)。由此可見(jiàn)，RAGE及NF-κB蛋白在OSAS疾病中表達(dá)是上調(diào)的。此外，通過(guò)檢測(cè)由NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)炎癥因子IL-6及TNF-α的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)A組小鼠血清IL-6、TNF-α及水平均較正常對(duì)照組小鼠明顯升高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明了在OSAS患者體內(nèi)IL-6、TNF-α表達(dá)亦是上調(diào)的。

因此，AGEs-RAGE/NF-κB信號(hào)通路在OSAS患者體內(nèi)是存在的：OSAS由于其慢性間歇缺氧的本質(zhì)，可上調(diào)AGEs及RAGE蛋白的表達(dá)，兩者結(jié)合后可激活氧化應(yīng)激，使活性氧簇生成增多，活性氧簇可通過(guò)PI3K、P38 MAPK、MAPK/Erk1,2等途徑活化NF-κB，NF-κB將信號(hào)傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控及轉(zhuǎn)錄下游的相關(guān)炎癥信號(hào)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)活化及放大，對(duì)各組織器官造成持續(xù)的損害。

3.4 大株紅景天及改善通氣對(duì)慢性間歇低氧小鼠的影響 紅景天是一種多年生草本植物，生長(zhǎng)在高原無(wú)污染地帶，能夠補(bǔ)氣清肺、益智養(yǎng)心，是一味作用廣泛的中藥，而大株紅景天注射液則是在紅景天基礎(chǔ)上提煉而成的注射液，其主要活性部分為紅景天苷，有著眾多的藥理作用。謝亮等[19]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究認(rèn)為，紅景天的腦保護(hù)作用機(jī)制可能與其改善缺血腦組織能量代謝，清除自由基和抗氧化作用有關(guān)。經(jīng)過(guò)提煉而成的大株紅景天可通過(guò)減輕心肌的氧化應(yīng)激反應(yīng)程度、降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的形成及減少一氧化氮的合成，對(duì)缺血再灌注的心肌起一定的保護(hù)作用[19]。因此，我們猜測(cè)大株紅景天可用于防治OSAS的多臟器損害。本實(shí)驗(yàn)在慢性間歇缺氧6周后的小鼠身上腹腔注射治療劑量的大株紅景天注射液4周，結(jié)果顯示，在大腦組織中，C組小鼠神經(jīng)元較A組有所增多，神經(jīng)纖維排列較緊密，核固縮深染現(xiàn)象亦較其減少。而在心臟組織中，A組小鼠心肌組織排列紊亂，結(jié)構(gòu)、紋理不清，部分肌細(xì)胞核固縮深染；C組小鼠心肌結(jié)構(gòu)較清楚，排列亦較緊密。而糾正缺氧后的慢性間歇低氧小鼠(B組)在心臟及大腦組織中亦有類似的病理改變，均較A組有所改善。因此，糾正缺氧狀態(tài)及給予大株紅景天注射液均可減輕慢性間歇低氧小鼠心臟、大腦組織的損害，而大株紅景天給藥方便，療效基本與CAPA相仿，或可在臨床上用于OSAS多臟器損害的防治。

有研究[20]表明，紅景天可降低血液中C反應(yīng)蛋白等炎癥介質(zhì)的水平，說(shuō)明了其具有一定的抗炎作用。而在本研究中，C組小鼠血清IL-6、TNF-α的水平較A組小鼠低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明了大株紅景天注射液在慢性間歇低氧小鼠中是有一定的抗炎作用的，這與上述研究結(jié)果相符。而在RAGE及NF-κB蛋白表達(dá)方面，小鼠心臟組織中，C組RAGE的表達(dá)與A組相仿，但NF-κB表達(dá)較其減少，而在大腦組織中，大株紅景天組的RAGE表達(dá)較A組稍有減少，而NF-κB表達(dá)則較其有更為明顯的下降。另外，各組小鼠血清AGEs結(jié)果顯示，雖C組小鼠有較A組降低的趨勢(shì)，但組間的差異卻無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示大株紅景天并不能通過(guò)下調(diào)AGEs及RAGE的表達(dá)來(lái)對(duì)慢性間歇低氧小鼠起保護(hù)作用。

綜上所述，OSAS可引起多器官、組織如心臟、大腦組織的損害。OSAS可激活A(yù)GEs-RAGE/NF-κB通路，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子，或是OSAS易合并多臟器損害的原因之一。而大株紅景天注射液有一定程度的抗炎作用，可用于防治OSAS多臟器的損害，但其作用機(jī)制與AGEs-RAGE/NF-κB信號(hào)通路的激活無(wú)明顯關(guān)系。