田苗苗，劉 揚(yáng)，修海楠，宋明洋，劉樹民

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040）

當(dāng)今乳腺癌疾病已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤的首位，其嚴(yán)重危害了當(dāng)代女性的生命健康[1]。近年來，利用中藥活性物質(zhì)治療各類腫瘤的實(shí)驗(yàn)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，許多中草藥及其提取物已被證實(shí)具有良好的防治乳腺癌的作用[2-3]?，F(xiàn)研究表明蒲公英活性成分主要為多糖、萜類、黃酮、植物甾醇、酚酸、內(nèi)酯、香豆素等[4-5]，其在乳腺癌治療方面體現(xiàn)出良好的苗頭[6]。蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz、堿地蒲公英的干燥全草。其味苦、甘，性寒。功效為清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋?？蓱?yīng)用于疔瘡腫毒，乳癰，瘰疬，咽痛，腸癰，熱淋澀痛[7]。本實(shí)驗(yàn)主要選擇了蒲公英水煎液、蒲公英多糖、蒲公英萜醇3 種提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 蒲公英（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院提供）；蒲公英萜醇購自于上海廣銳生物科技有限公司（批號(hào)：180402）。實(shí)驗(yàn)前用DMEM 完全培養(yǎng)液溶解制成相應(yīng)濃度藥液供使用。蒲公英全草干燥后粉碎過40目篩，用石油醚連續(xù)回流6 h，殘?jiān)凑?:20料液比，85 ℃水提2.5 h，提取2 次，Sevag 法除蛋白，藥液以85%乙醇沉淀，離心取沉淀物，無水乙醇洗滌數(shù)次，水復(fù)溶后冷凍干燥，即得蒲公英粗多糖[8-9]。按下式計(jì)算多糖得率：多糖得率＝多糖質(zhì)量/蒲公英干燥全草質(zhì)量×100%[10]，多糖得率為4.54%。蒲公英全草，按1:20 料液比，90 ℃水提2 次，每次2 h，蒲公英水煎液出粉率21.82%。人乳腺癌T47D 細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；人乳腺癌SK-BR-3 細(xì)胞購于ATCC 細(xì)胞庫。T47D、SK-BR-3 乳腺癌細(xì)胞均用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，放置于5%CO2，37 ℃的恒溫水浴培養(yǎng)箱中，選擇狀態(tài)最佳的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，使細(xì)胞的最終密度為5×104/mL。DMEM高糖培養(yǎng)液（批號(hào)：8118245）、胎牛血清（批號(hào)：1739463）購自美國Gibco 公司，PBS 緩沖液（批號(hào)：170919）購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，雙抗（批號(hào)：171019）購自上?；鶎?shí)有限公司，胰蛋白酶（批號(hào)：090617171012）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：060818181029）購自碧云天有限公司，CCK-8 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：LK815）購自日本同仁化學(xué)研究所。二氧化碳培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；倒置顯微鏡（奧林巴斯科技有限公司）；離心機(jī)（湘儀集團(tuán)有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；流式細(xì)胞儀（默克密理博有限公司）；RTCA 細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)控儀（賽默飛世爾公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將密度為5×104/mL的細(xì)胞以每孔100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，24 h 后將3 板細(xì)胞分別隨機(jī)分為7 組，即空白對(duì)照組、蒲公英水煎液25、50、100、150、200、300 mg/mL 組；空白對(duì)照組、蒲公英多糖6 個(gè)濃度組，25、50、100、150、200、300 mg/mL 組；空白對(duì)照組、蒲公英萜醇6 個(gè)濃度組，25、50、100、150、200、300 μmol/L，每組5 個(gè)復(fù)孔。加藥結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將各組細(xì)胞改用終濃度含10% CCK-8 的培養(yǎng)基進(jìn)行溫育2 h，隨后在酶標(biāo)儀450 nm 處讀取吸光度（OD）值。

1.2.2 實(shí)時(shí)xCELLigence 細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖毒性 基線檢測(cè)所有孔Cell Index 低于0.063，將密度為5×104/mL 的T47D、SK-BR-3 細(xì)胞懸液以每孔100 μL接種于E-Plate 16 板中，室溫放置30 min。開始Step2（24 h檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線），24 h 后給予藥物，藥物濃度，同2.1，開始Step3，檢測(cè)48 h 內(nèi)細(xì)胞增殖毒性。

1.2.3 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 在6 孔板背后，間隔0.5 cm均勻劃5 條直線，每孔加入約1×105個(gè)T47D 乳腺癌細(xì)胞，24 h 后制造劃痕，用PBS 溶液沖洗，加入不同濃度的蒲公英萜醇同2.1 繼續(xù)培養(yǎng)。按0，24，48 h取樣，拍照測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算各藥物濃度組細(xì)胞遷移抑制率。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將T47D 細(xì)胞以1×105/mL 接種至6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將狀態(tài)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為7 個(gè)蒲公英萜醇終濃度組，同2.1。待加樣結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，清洗、消化、離心棄上清液，吸取100 μL Binding buffer 加入至上述各離心管中，隨后加入5 μL AnnexinV-FITC，室溫下避光溫育l0 min，向上述離心管中加入1 μLPI (100 μg/μL）染色液，避光反應(yīng)5 min，再加入400 μL 結(jié)合緩沖液，運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0 軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 由表1 可知T47D乳腺癌細(xì)胞經(jīng)3 種藥物作用48 h 后，蒲公英萜醇50～300 μmol/L 組與對(duì)照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01），最高抑制率可達(dá)67.19%；蒲公英多糖100～300 mg/mL 組與對(duì)照組比較抑制作用顯著（P＜0.05 或P＜0.01），但抑制作用較蒲公英萜醇弱；蒲公英水煎液100～300 mg/mL 組與對(duì)照組比較有較顯著的抑制作用（P＜0.05），其抑制作用最弱。

表1 蒲公英提取物各藥物濃度組對(duì)T47D 細(xì)胞增殖的影響（，n =5）

表1 蒲公英提取物各藥物濃度組對(duì)T47D 細(xì)胞增殖的影響（，n =5）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

由表2 可知SK-BR-3 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)3 種藥物作用48 h 后，蒲公英萜醇100～300 μmol/L 組與對(duì)照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05 或P＜0.01），其最大抑制率為43.15%；蒲公英多糖100～300 mg/mL 組與對(duì)照組比較抑制作用顯著（P＜0.05）；蒲公英水煎液100～300 mg/mL組與對(duì)照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05 或P＜0.01），蒲公英萜醇對(duì)SK-BR-3 乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用較蒲公英多糖和蒲公英水煎液強(qiáng)。

表2 蒲公英提取物各藥物濃度組對(duì)SK-BR-3 細(xì)胞增殖的影響（，n =5）

表2 蒲公英提取物各藥物濃度組對(duì)SK-BR-3 細(xì)胞增殖的影響（，n =5）

注：與對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.2 實(shí)時(shí)xCELLigence 細(xì)胞分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖毒性 由圖1、2、3 可知T47D 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，各藥物濃度組與對(duì)照組比較對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。蒲公英萜醇對(duì)T47D乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，72 h 時(shí)抑制率可達(dá)到70.50%。

圖1 蒲公英萜醇組T47D 細(xì)胞增殖曲線

圖2 蒲公英多糖組T47D 細(xì)胞增殖曲線

圖3 蒲公英水煎液組T47D 細(xì)胞增殖曲線

由圖4、5、6 分可知SK-BR-3 乳腺癌細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，各藥物濃度組與對(duì)照組比較均有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性。蒲公英萜醇對(duì)SK-BR-3 乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，72 h 時(shí)抑制率可達(dá)45.67%。

圖4 蒲公英萜醇組SK-BR-3 細(xì)胞增殖曲線

圖5 蒲公英多糖組SK-BR-3 細(xì)胞增殖曲線

圖6 蒲公英水煎液組SK-BR-3 細(xì)胞增殖曲線

2.3 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) T47D 乳腺癌細(xì)胞劃痕經(jīng)不同濃度蒲公英萜醇作用24、48 h 后，各濃度組與對(duì)照組比較均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性和時(shí)間劑量依賴性。蒲公英萜醇（100～300 μmol/L）作用48 h 后，T47D 乳腺癌細(xì)胞劃痕愈合顯著被抑制，最大遷移抑制率可達(dá)74.43%。見圖7。

圖7 蒲公英萜醇對(duì)T47D 乳腺癌細(xì)胞劃痕愈合的影響

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 經(jīng)蒲公英萜醇作用48 h 后，各濃度組與對(duì)照組比較T47D 細(xì)胞凋亡率均有一定程度增加，且呈劑量依賴性。蒲公英萜醇（100～300 μmol/L）組作用48 h 后誘導(dǎo)T47D 乳腺癌細(xì)胞凋亡作用顯著，見圖8。

圖8 蒲公英萜醇對(duì)T47D 乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

乳腺癌是生長于乳腺腺泡上皮或者乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率居于當(dāng)今女性腫瘤的首位[11]，雖然有關(guān)乳腺癌的臨床實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但乳腺癌患者的病死率仍持逐年上升狀態(tài)[12]。PR、ER、Her-2 在乳腺癌的發(fā)病過程中起到一定作用，針對(duì)受體表達(dá)狀態(tài)，浸潤性乳腺癌大致可分為3 種分子亞型，LuminalA、B 型，三陰型和Her-2 過表達(dá)型[13-14]。不同細(xì)胞亞型的乳腺癌治療方案有所不同，ER 陽性主要采用內(nèi)分泌治療法，Lumina A 型只進(jìn)行內(nèi)分泌治療，就能得到良好的治療效果[15-16]；而ER陰性，Her-2 高表達(dá)的乳腺癌可以針對(duì)Her-2 因子靶向治療[17-18]，但由于三陰性乳腺癌腫瘤惡化程度較高，采用內(nèi)分泌治療基本無效，同時(shí)缺乏有效的治療靶點(diǎn)[19-20]，現(xiàn)主要采用化療法治療，藥物治療效果不明顯，所以本實(shí)驗(yàn)未選取三陰型乳腺癌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)選取蒲公英水煎液、蒲公英多糖、蒲公英萜醇分別作用于雌激素依賴Luminal 型T47D 乳腺癌細(xì)胞、Her-2 過表達(dá)型SK-BR-3 乳腺癌細(xì)胞，進(jìn)行蒲公英提取物抑制乳腺癌細(xì)胞增殖作用的初篩。

3 種提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖均有一定抑制作用，CCK-8 增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞增殖毒性檢測(cè)結(jié)果顯示單體蒲公英萜醇抑制乳腺癌細(xì)胞增殖作用更為明顯，50 μmol/L 時(shí)抑制率可達(dá)26.49%，最高抑制率可達(dá)70.50%，蒲公英多糖和水煎液組相對(duì)抑制率較低。蒲公英各種成分對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用呈現(xiàn)一定的差異性，蒲公英其他成分是否具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3 種提取物對(duì)T47D 細(xì)胞增殖的抑制作用明顯高于對(duì)SKBR-3 細(xì)胞的抑制作用。T47D 細(xì)胞屬于雌激素依賴型乳腺癌細(xì)胞，有研究表明內(nèi)分泌療法成為一種重要的治療激素依賴型乳腺癌的療法，推測(cè)蒲公英很可能通過調(diào)節(jié)T47D 乳腺癌細(xì)胞雌激素受體ER，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞異常增殖的作用。由于SK-BR-3 細(xì)胞中Her-2呈過表達(dá)狀態(tài)，需要針對(duì)Her-2 因子靶向治療，才能得到更好的治療效果，蒲公英提取物對(duì)其的抑制作用較對(duì)T47D 細(xì)胞的抑制作用弱。因此劃痕愈合實(shí)驗(yàn)以及凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)只選取蒲公英萜醇作為實(shí)驗(yàn)研究藥物，T47D 乳腺癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蒲公英萜醇可通過抑制T47D 乳腺癌細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)其凋亡，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但相關(guān)的凋亡通路還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

中藥發(fā)揮抗腫瘤作用是多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的，且其作用的機(jī)制十分復(fù)雜[21-22]。能夠進(jìn)一步明確蒲公英提取物對(duì)乳腺癌不同環(huán)節(jié)的作用機(jī)制，對(duì)今后更深入研究蒲公英對(duì)乳腺癌的治療作用有很大幫助。蒲公英不同藥用部位的提取物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖是否具有同樣的抑制作用，以及所含的不同成分對(duì)同種類型乳腺癌治療作用的平行性差異都應(yīng)進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究。蒲公英作為抗腫瘤的天然藥物，仍具有很大的藥用研究潛力，其治療乳腺癌的機(jī)制可能是今后此類實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。