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        陰陽(yáng)共調(diào)湯干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的實(shí)驗(yàn)研究

        2020-11-04 02:04:00陳藝緣張茂云梁健峰白瀟嫻王柏淇劉宏巖郭軍鵬錢(qián)婷婷劉巖松
        吉林中醫(yī)藥 2020年10期
        關(guān)鍵詞:小鼠模型

        陳藝緣,張茂云,孫 睿,梁健峰,白瀟嫻,王柏淇,劉宏巖,郭軍鵬,錢(qián)婷婷,劉巖松

        (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117)

        骨質(zhì)疏松癥是一種全身性骨病,表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構(gòu)損傷和骨量減少,骨脆性增加導(dǎo)致骨折易發(fā),尤其以絕經(jīng)后的女性和老年男性最為多見(jiàn)[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMPO)是由于絕經(jīng)后卵巢功能衰退引起雌激素水平分泌降低的一種代謝性疾病[2],致使患者易骨折,嚴(yán)重可致殘甚至致死。目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥主要以抑制骨吸收藥物、促進(jìn)骨形成藥物、骨礦物藥物為主,如雌激素、鈣劑、甲狀旁腺素等。這些藥物在臨床上有著良好的效果,但此類藥物大多需要長(zhǎng)時(shí)間服用,這種服藥方式會(huì)帶來(lái)很多不良反應(yīng),如雌激素的長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用會(huì)提高罹患子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生概率[3],除此外還有增加異常子宮出血、卵巢癌等風(fēng)險(xiǎn)[4]。為降低雌激素等治療藥物帶來(lái)的不良反應(yīng),同時(shí)有效干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,近年來(lái)中醫(yī)學(xué)界對(duì)于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的研究頗多,如何更好地防止絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥成為研究的熱點(diǎn)。

        中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥這一病名,根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其劃歸為“骨痿”“骨枯”“腰痛”等范疇[5]。中醫(yī)認(rèn)為,本病發(fā)病緩慢,《素問(wèn)·上古天真論篇第一》:“七七,任脈虛太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無(wú)子?!苯^經(jīng)后天癸竭,以致腎精虧虛,日久髓海空虛是該病之病機(jī)。治療大多以“滋陰、補(bǔ)腎、健脾”[6]立著。筆者在研究中發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后婦女雖以陰虛多見(jiàn),但臨床多以陰陽(yáng)兩虛之證候同時(shí)出現(xiàn),當(dāng)以“陰陽(yáng)共調(diào)”論治。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)去卵巢術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型,對(duì)比陰陽(yáng)共調(diào)湯、雌激素、金匱腎氣丸湯劑、六味地黃湯對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的影響,進(jìn)行該項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以期提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為以后研究提供新依據(jù),為臨床提供新思路。

        1 材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 陰陽(yáng)共調(diào)湯由熟地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,澤瀉9 g,茯苓9 g,牡丹皮12 g,葛根12 g,龜板9 g,女貞子12 g,淫羊藿12 g,巴戟天12 g 組成;金匱腎氣丸湯由生地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,澤瀉9 g,茯苓9 g,牡丹皮9 g,桂枝3 g,炮附子3 g組成;六味地黃湯由熟地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,澤瀉9 g,牡丹皮9 g,茯苓9 g 組成。所有藥物均來(lái)自于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房,3 種中藥劑根據(jù)小鼠與人體質(zhì)量1:0.035 比例配比,煎煮時(shí)予8 倍水、6 倍水6 次濃縮至30 mL。對(duì)照組予補(bǔ)佳樂(lè)1 mg 配比溶液。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 月齡SD 雌性小鼠60 只,體質(zhì)量(20±7.7)g。所有小鼠均購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào):SCXK(遼)2015-0001,常規(guī)飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

        1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 蘇木素液,伊紅染色液,梯度濃度乙醇,二甲苯,多聚甲醛,青霉素,羧甲基纖維素鈉,超純水等。石蠟包埋機(jī)(HIS-TOCENTRE),石蠟切片機(jī)(FINESSE),HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),奧林巴斯BX40顯微鏡,小動(dòng)物骨強(qiáng)度儀。

        2 方法

        2.1 造模 除假手術(shù)組、模型組外,其余各組小鼠以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。卵巢切除術(shù):1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,將小鼠仰臥于手術(shù)臺(tái)上,四肢固定,腹部正中偏下處備皮,絡(luò)合碘消毒,切開(kāi)皮膚,于腹白線依次切開(kāi)肌肉,剪開(kāi)腹膜進(jìn)入腹腔,可見(jiàn)乳白色組織。輕輕將之拉出腹腔,即可見(jiàn)被包裹的粉紅色高粱米大小“桑葚樣”卵巢,分離后鉗夾、結(jié)扎,剪去卵巢,檢查有無(wú)滲血,分層縫合皮膚,絡(luò)合碘切口消毒。待麻醉蘇醒。小鼠術(shù)后均口服青霉素混懸液(2 萬(wàn)U/mL)抗感染,連續(xù)3 d。常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水?dāng)z食,并注意觀察小鼠的情況。

        2.2 劑量及灌胃 在小鼠接受造模處理后第31 天,進(jìn)行藥物干預(yù)。陰陽(yáng)共調(diào)湯組、金匱腎氣丸湯劑組、六味地黃湯組分別予對(duì)應(yīng)藥劑0.3 mL 灌胃;對(duì)照組給予補(bǔ)佳樂(lè)混懸液0.3 mL;假手術(shù)組、模型組口服等體積的超純水。每日1 次,連續(xù)給藥90 d。

        2.3 取材 第91 天采取斷頭法處死小鼠,處死前一晚斷糧供水,在無(wú)菌操作下剝離子宮,稱其重量,剪斷雙側(cè)脛骨、股骨,分離肌肉,測(cè)量骨強(qiáng)度值,脛骨、股骨脫鈣2 周處理,切片染色以觀察骨小梁、干骺端。

        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表達(dá),組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析;技術(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

        3 結(jié)果

        3.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型體質(zhì)量變化 分別測(cè)定小鼠術(shù)后30、60、90 d(處死前)的體質(zhì)量變化,如表1。術(shù)后30天與模型組相比,各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異;術(shù)后60 天,與模型組相比,對(duì)照組體質(zhì)量增高、金匱腎氣丸湯劑組體質(zhì)量降低,均有顯著差異;術(shù)后90 天(處死前),與模型組相比較,陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組與六味地黃湯劑組體質(zhì)量降低,有顯著差異,與對(duì)照組相比較,陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組沒(méi)有顯著差異。

        表1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型體質(zhì)量變化 g

        3.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠子宮重量 分別測(cè)定小鼠處死后的子宮重量,如表2。與模型組相比較,對(duì)照組與陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組子宮重量增高,有顯著差異;與對(duì)照組相比較,陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組無(wú)顯著差異。

        表2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠子宮重量

        3.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強(qiáng)度值 取右側(cè)股骨,放置于小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀上,根據(jù)骨壓碎最大荷載壓力,測(cè)定骨骼強(qiáng)度,如表3。

        表3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強(qiáng)度值 kg

        3.4 HE 染色小鼠股骨、脛骨冠狀面光鏡圖 分別在4倍鏡、10 倍鏡下觀察骨小梁與干骺端,如圖4、5、6、7。從圖可看出,在4 倍鏡、10 倍鏡下,可以看出,假手術(shù)組骨細(xì)胞內(nèi)含量豐富,干骺端骨量正常分布,骨小梁排列規(guī)律,脛骨、股骨細(xì)胞中無(wú)空洞現(xiàn)象,結(jié)構(gòu)緊密,密度正常。模型組的脛骨和股骨細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)多處空洞、骨小梁斷裂、干骺端骨量流失且分布不均勻,骨組織明顯減少,結(jié)構(gòu)疏松,證明雙側(cè)卵巢切除術(shù)可以模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松這一模型。與模型組相比,陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組的股骨與脛骨的骨小梁之間聯(lián)系更為緊密,排列更有規(guī)律,而模型組骨小梁稀疏纖細(xì),有斷裂、分層;與模型組相比較,干骺端骨量明顯增多。

        4 討論

        圖4 4 倍鏡下股骨骨小梁與干骺端

        圖5 10 倍鏡下股骨骨小梁與干骺端

        圖6 4 倍鏡下脛骨骨小梁與干骺端

        圖7 10 倍鏡下脛骨骨小梁與干骺端

        中醫(yī)認(rèn)為,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥由多種病機(jī)所致,以腎精虧虛為本,同時(shí)與肝脾兩臟有關(guān)[7]?!澳I主骨,生髓?!惫撬璧某溆蕾囉谀I精的滋養(yǎng),從而使骨骼強(qiáng)健有力[8]。李建國(guó)認(rèn)為,女子以肝為先天,女性的特殊生理、病理都與肝的關(guān)系極為密切,女性的生理特點(diǎn)決定了其易于引起肝血虧虛之證,導(dǎo)致肝藏血及疏泄功能失職,引發(fā)陰虛血虧,不能濡養(yǎng)筋骨[9];絕經(jīng)后婦女脾氣虧虛,氣血生化無(wú)源,無(wú)以填充骨髓,則骨枯髓減,四肢廢痿[10]。但筆者在臨床中發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥陰陽(yáng)兩虛者甚多?!疤旃镏?,月事以時(shí)下;天癸竭,地道不通”,彭勛潛認(rèn)為女子來(lái)潮、絕經(jīng)都與天癸有著密不可分的關(guān)系,天癸竭則月經(jīng)竭,進(jìn)而發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[11]?!疤旃锝摺敝饕憩F(xiàn)為腎陰虛、腎陽(yáng)虛或陰陽(yáng)俱虛等臨床表現(xiàn)[12]。周艷認(rèn)為,陰陽(yáng)失衡則諸證峰起[13]。陽(yáng)存于陰,陰存于陽(yáng),“孤陰不生,獨(dú)陽(yáng)不長(zhǎng)”,陰陽(yáng)互根互用,雙方具有互相滋生、促進(jìn)的作用,同時(shí)也會(huì)“陽(yáng)損及陰,陰損及陽(yáng)”,故而絕經(jīng)后婦女易于出現(xiàn)陰陽(yáng)兩虛之證,在治療上施以“陰陽(yáng)共調(diào)”之法,以期使陰陽(yáng)復(fù)交,正氣盛則病自去[14]。

        本實(shí)驗(yàn)采用的去卵巢骨質(zhì)疏松模型是目前最常用的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[15]。該模型采用手術(shù)切除小鼠雙側(cè)卵巢的方法后,其骨代謝活躍,骨量明顯丟失;雌激素水平下降,骨密度值降低,較好的模擬了女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的雌激素水平下降,骨密度值下降,骨強(qiáng)度值下降,骨量丟失加速,鈣、磷等礦物質(zhì)代謝紊亂,破壞了骨形成與骨吸收間的骨代謝平衡,破骨細(xì)胞吸收的骨量大于成骨細(xì)胞形成的骨量,導(dǎo)致凈骨量丟失的特點(diǎn)[16]。

        目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物主要有雌激素補(bǔ)充劑、雷洛昔芬[17]、降鈣素[18]等,并且有相關(guān)研究表明維生素D 可以調(diào)節(jié)鈣磷及骨代謝[19]。

        本實(shí)驗(yàn)探究陰陽(yáng)共調(diào)湯對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠骨強(qiáng)度、骨小梁、干骺端等指標(biāo)的影響。病理切片提示陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組與對(duì)照組干預(yù)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠有良好的效果,可以明顯改善骨質(zhì)疏松的病理形態(tài),增加骨小梁面積和厚度、增加干骺端的骨量;骨強(qiáng)度提示陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組與對(duì)照組能夠顯著提升小鼠的股骨強(qiáng)度,提高荷載能力。陰陽(yáng)共調(diào)湯劑組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)并無(wú)顯著差異,可以認(rèn)為,陰陽(yáng)共調(diào)湯與雌激素效力相當(dāng)。相較于雌激素的使用,陰陽(yáng)共調(diào)湯可以降低致癌或靜脈血栓[20]等不良反應(yīng),更為安全、健康。研究結(jié)果可以為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的臨床提供新的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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