盧 君，張 穎，李福榮，唐 平，山其木格，孟天毅，梁青松，張 樂，馮國躍，張翠英，肖冬光，李長文

（1.貴州國臺酒業(yè)股份有限公司，貴州 仁懷 564501；2.天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410；3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

近年來，醬香型白酒以其獨特的感官風(fēng)味和更為舒適的飲后體征感受，越來越受到消費者的青睞。醬香型白酒的酒體中包含了種類更為豐富的風(fēng)味物質(zhì)和生物活性組分[1-4]，如四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），近年來受到廣泛的關(guān)注，被認為是與醬香風(fēng)格密切相關(guān)的物質(zhì)，同時也是行業(yè)中公認的“健康因子”[5]，具有增加腦血管的血流量，減少腦缺血性疾病的發(fā)作、改善學(xué)習(xí)的障礙[6]、防止由無水乙醇引起的胃粘膜損傷和腎中毒[7-8]、防止由硫代乙酰胺引起的急性肝中毒[9]、降低腦萎縮的傷害[10]、防止肝纖維化等功效[11]、分解甘油三酯[12]、改善高血糖、抑制α-葡萄糖苷酶活性，同時具有體外抗炎作用[13]等諸多健康功效。

隨著“健康中國”發(fā)展戰(zhàn)略的制定和實施，消費者對于飲酒的態(tài)度越來越理性，對于白酒健康層面的需求越來越強烈。由于醬香型白酒的獨特工藝特點，健康因子——四甲基吡嗪，仍然是研究的熱點。中國工程院孫寶國院士提出“白酒的發(fā)展方向是健康，健康白酒應(yīng)該通過‘內(nèi)尋外加，自然強化’來實現(xiàn)”[14]。在實際釀酒生產(chǎn)過程中，從制曲、堆積或發(fā)酵階段篩選出高產(chǎn)四甲基吡嗪的微生物，并應(yīng)用強化到特定的生產(chǎn)發(fā)酵階段，這種方式是常見的高產(chǎn)四甲基吡嗪的手段。王西等[15]將從高溫大曲中篩選得到的產(chǎn)香枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）應(yīng)用到醬香型白酒生產(chǎn)中，結(jié)果顯示堆積組發(fā)酵后的糟醅中四甲基吡嗪相對含量達到6.98 μg/g，是空白組的4.56倍；王曉丹等[16]將篩選得到的一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）強化到粹沙工藝醬香白酒發(fā)酵的酒醅中，發(fā)酵后酒醅中的四甲基吡嗪含量是對照組的3.03倍。

以往的研究，僅應(yīng)用菌種強化發(fā)酵的單一手段來提高基酒中的四甲基吡嗪含量。本研究針對醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的實際生產(chǎn)工藝，對比了3種方法對醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量的影響，即利用菌種強化的方式，在釀酒發(fā)酵階段，通過功能微生物代謝提高基酒中四甲基吡嗪的含量；利用工藝優(yōu)化方式，將菌劑加入尾酒中浸提得到高含量四甲基吡嗪的浸提液，在烤酒階段，通過蒸餾方式（浸提液加入地鍋串蒸）使四甲基吡嗪遷移入基酒中；應(yīng)用菌種強化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法。旨在為進一步提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量提供一種新的、可被企業(yè)實際應(yīng)用的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和曲粉

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）M2（MBJ09001）：分離自茅臺鎮(zhèn)某酒廠高溫大曲，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏編號為CGMCC 18734。曲粉：貴州國臺酒業(yè)五輪次釀酒生產(chǎn)時期的生產(chǎn)用曲粉。

1.1.2 試劑

小麥：某酒廠提供；四甲基吡嗪（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；2-乙?；拎ぃㄉV純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鈉（分析純）：天津市匯杭化工科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市康科德科技有限公司；甲酸（色譜純）：美國Fluka公司；甲醇（色譜純）：德國默克公司；蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2-乙基丁酸（色譜純）：天津市光復(fù)精細化工研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基[17]：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH=7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15 g。

1.2 儀器與設(shè)備

BPS-250HC高溫培養(yǎng)箱：上海申騁儀器科技有限公司；Q-Trap 5500三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）儀：美國AB SCIEX公司；UFLC超高效液相系統(tǒng)：島津（上海）實驗器材有限公司；DGG-101-1BS電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市天宇實驗儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；LMQ.C-80E立式滅菌器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；IT-09A5磁力攪拌器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑的制備

菌種活化：從甘油管保存的枯草芽孢桿菌M2中挑取少許菌體，在LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18 h，長出單菌落后挑取單菌落再次劃線，以此重復(fù)三次，對菌株進行活化和純化。

一級種子液：從活化后的枯草芽孢桿菌M2平板挑取少許單菌落菌體接種于LB液體培養(yǎng)基，裝液量15 mL/150 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。

二級種子液：將一級種子液按10%（V/V）的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，裝液量150 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至生長穩(wěn)定期。

固體菌劑制備：稱取麥沙（從酒廠制曲車間取得，與實際制曲生產(chǎn)時粉碎度相同的磨碎的小麥，已加水，但未添加母曲）和麥粉（用粉碎機粉碎的小麥粉），裝入不銹鋼盆中，每個不銹鋼盆中麥粉和麥沙按質(zhì)量比1∶1混勻。每盆3 kg原料中加入300 mL二級種子液（接種量為10%）和750 mL水，最終水分含量為37.1%。不銹鋼盆上覆蓋紗布，放入高溫培養(yǎng)箱中進行固體培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，第1天在培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h；第2天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至44 ℃，持續(xù)1 d；發(fā)酵第3天將培養(yǎng)溫度調(diào)整至52 ℃，高溫生香保持2 d；以此條件循環(huán)兩次制備得到固體菌劑。發(fā)酵過程中觀察發(fā)酵情況，每天根據(jù)濕度補水、攪拌、測量溫度。

1.3.2 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑的生產(chǎn)應(yīng)用方式

菌種強化方式[17]：將制備得到的菌劑自然干燥后再進行磨粉，應(yīng)用于2019年貴州國臺酒業(yè)五輪次基酒的生產(chǎn)中，選取了三車間9班8號窖池作為實驗窖池，另選擇該班組其他4個窖池作為對照窖池。應(yīng)用功能枯草芽孢桿菌M2制作的固態(tài)菌劑（干燥粉碎后）（共10 kg）強化到醬香型白酒堆積發(fā)酵結(jié)束后、入窖發(fā)酵之前窖池的上層糟醅中，菌劑與普通曲粉的質(zhì)量比為1∶5，跟蹤發(fā)酵生產(chǎn)進程，經(jīng)過一個輪次的發(fā)酵后（30 d），開窖烤取基酒，評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

工藝優(yōu)化方式：將制備得到的高含量四甲基吡嗪的菌劑，按照1∶10的質(zhì)量比添加到醬香型白酒基酒生產(chǎn)過程產(chǎn)生的頭尾酒中，浸泡7 d，獲得頭尾酒浸提液，再將頭尾酒浸提液替代普通頭尾酒，倒回地鍋，通過蒸餾烤酒使得浸提液中的四甲基吡嗪遷移至基酒中，評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

菌種強化結(jié)合工藝優(yōu)化方式：應(yīng)用上述菌種強化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方式，即在釀酒生產(chǎn)階段進行菌種強化，在蒸餾烤酒階段進行工藝優(yōu)化。在2019年貴州國臺酒業(yè)六輪次基酒的生產(chǎn)過程中，選取了一車間1班6號窖池作為實驗窖池，該班組其他窖池均為對照窖池。評定基酒中四甲基吡嗪的含量和感官質(zhì)量的差異。

1.3.3 分析檢測方法

（1）四甲基吡嗪的檢測方法

曲粉/菌劑樣品前處理：稱取2.8 g粉碎后的曲粉/菌劑樣品，加入20 mL體積分數(shù)為53%的乙醇溶液，浸泡10 min，25 ℃條件下超聲提取30 min，超聲功率250 W，超聲頻率40 kHz，20 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，稀釋至合適倍數(shù)后過0.45 μm的有機濾膜，取過濾后樣品1 mL于液相樣品瓶中，供液質(zhì)分析。

基酒酒樣前處理：基酒酒樣稀釋至合適倍數(shù)后過0.45μm的有機濾膜，取過濾后樣品1 mL于液相樣品瓶中，供液質(zhì)分析。

采用HPLC-MS檢測四甲基吡嗪含量，參考以往文獻報道的方法進行優(yōu)化[18-21]，液相色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫35 ℃；流動相為甲醇：0.1%甲酸=35∶65（V/V）；流速0.4 mL/min；洗脫梯度：0.01～1 min，10%甲醇；1～5 min，35%甲醇。質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，具體參數(shù)見表1。

表1 HPLC-MS法測定四甲基吡嗪多反應(yīng)監(jiān)測模式條件參數(shù)Table 1 Parameters of multiple reaction monitoring mode for tetramethylpyrazine determined by HPLC-MS

正離子模式下，以四甲基吡嗪標準品的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)匹配，結(jié)合二級特征碎片離子，實現(xiàn)定性分析。采用外標法進行四甲基吡嗪的定量分析。

（2）理化指標檢測方法

菌劑和大曲的酸度測定采用酸堿滴定法，糖化力采用菲林滴定法，具體檢測方法參見《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書》[22]。

（3）基酒感官品評方法[23]

組織4位國家一級品酒師，對本研究中的基酒樣品進行感官品評，分別從曲香、醬香、酒體醇和度、后味、干凈度這5個維度進行打分評價（0～9分，0代表感知不到，9代表特征極為明顯）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)四甲基吡嗪菌劑制備結(jié)果

測定制備的菌劑和生產(chǎn)用曲粉的酸度、糖化力和四甲基吡嗪含量，并進行對比分析，結(jié)果見表2。由表2可知，制備的菌劑酸度相比于生產(chǎn)用曲粉酸度更高，推測其原因是強化菌株枯草芽孢桿菌M2（MBJ09001）的代謝產(chǎn)酸能力更強。菌劑中的四甲基吡嗪的含量（627.15 μg/g）是生產(chǎn)用曲粉的160倍，說明應(yīng)用枯草芽孢桿菌M2進行發(fā)酵能夠代謝產(chǎn)生高含量的四甲基吡嗪。同時，制備的菌劑糖化力（20.16 mg/（g·h））很低，但對于本研究來說并不影響后續(xù)的發(fā)酵階段強化和蒸餾烤酒應(yīng)用的要求。

表2 制備的菌劑與生產(chǎn)用曲粉指標差異Table 2 Differences of indexes between prepared microbial agents and Daqu powder for production

2.2 菌種強化方式提高基酒中四甲基吡嗪含量的生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果

不同窖池烤取的基酒中四甲基吡嗪的含量見圖1。由圖1可知，實驗窖池烤取的基酒中四甲基吡嗪含量為16.06 mg/L，比對照窖池烤取的基酒中四甲基吡嗪的平均含量（6.16 mg/L）提高160.71%，說明利用菌種強化的方式能夠大幅提高基酒中四甲基吡嗪的含量，與以往的研究結(jié)果一致[15-17]。

圖1 菌種強化方式提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量結(jié)果Fig.1 Results of improving tetramethylpyrazine content in sauceflavor Baijiu base liquor by strain strengthening

2.3 工藝優(yōu)化方式提高基酒中四甲基吡嗪含量的生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果

醬香型白酒在蒸餾烤酒過程中會生產(chǎn)出基酒和尾酒?；浦傅氖蔷凭葹?3%vol左右的酒（一輪次基酒57%vol、二輪次基酒54.5%vol、三輪次基酒53.5%、四至五輪次基酒53%vol、六至七輪次基酒52%vol）。在烤酒過程中，當酒精度下降至8%vol～15%vol時，此時收集得到的酒稱為頭尾酒；酒精度降至5%vol～8%vol時，此時收集得到的酒稱為二尾酒。為了回收頭尾酒中的酒分子以提高基酒的產(chǎn)量，生產(chǎn)過程中會將上一排的頭尾酒倒入下一排的地鍋中，在蒸餾烤酒過程中使得頭尾酒中的酒分子串蒸至下一排的基酒中，因此也就增加了基酒的產(chǎn)量，這是醬香型白酒釀造過程中常見而普遍采用的工藝。根據(jù)這個工藝特點，嘗試用頭尾酒來浸泡高含量四甲基吡嗪菌劑的方法，使四甲基吡嗪通過浸提遷移至頭尾酒中。再利用浸提過菌劑的尾酒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的尾酒進行地鍋串蒸，這樣既回收了酒分子，同時也有益于四甲基吡嗪通過串蒸遷移至基酒中，從而提高基酒中四甲基吡嗪的含量。

本研究將高含量四甲基吡嗪的菌劑浸泡在頭尾酒中7 d，四甲基吡嗪浸提效果見圖2。由圖2可知，隨著浸泡時間的增加，尾酒中四甲基吡嗪含量逐漸增加，從最初頭尾酒中僅含有6.70 mg/L增加到第7天時的66.35 mg/L，說明四甲基吡嗪具有較好的醇溶性，利用浸提的方法能夠使得頭尾酒中富集高含量的四甲基吡嗪。

圖2 醬香型白酒頭尾酒提取四甲基吡嗪的效果Fig.2 Effect of tetramethylpyrazine extraction from tail spirit of sauce-flavor Baijiu

將經(jīng)過7 d浸提菌劑后的頭尾酒代替普通頭尾酒，回地鍋蒸餾，檢測基酒中的四甲基吡嗪含量，用普通尾酒回地鍋后烤取的基酒作為對照，結(jié)果見圖3。由圖3可知，工藝優(yōu)化后基酒中四甲基吡嗪的含量為8.60 mg/L，而應(yīng)用傳統(tǒng)工藝烤取的基酒中四甲基吡嗪含量為4.63 mg/L，工藝優(yōu)化后的基酒中四甲基吡嗪的含量提升了85.75%。

圖3 工藝優(yōu)化方式提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量結(jié)果Fig.3 Results of improving tetramethylpyrazine content in sauceflavor Baijiu base liquor by process optimization

2.4 菌種強化結(jié)合工藝優(yōu)化方式提高基酒中四甲基吡嗪含量的生產(chǎn)應(yīng)用結(jié)果

應(yīng)用菌種強化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法進一步提升醬香型白酒基酒中的四甲基吡嗪含量。對同一個窖池在發(fā)酵階段和蒸餾階段采用上述兩種工藝，以傳統(tǒng)工藝釀造的基酒作為對照，基酒中四甲基吡嗪的含量見圖4。由圖4可知，實驗窖池對應(yīng)的基酒中四甲基吡嗪含量達到了21.98 mg/L，而應(yīng)用傳統(tǒng)工藝對應(yīng)的基酒中四甲基吡嗪的平均含量為7.26 mg/L，菌種強化結(jié)合工藝優(yōu)化后的基酒中四甲基吡嗪的含量提升了202.75%。

圖4 菌種強化結(jié)合工藝優(yōu)化方式提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量結(jié)果Fig.4 Results of improving tetramethylpyrazine content in sauceflavor Baijiu base liquor by strain strengthening combined with process optimization

對比應(yīng)用以上3種方法提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于單一采用菌種強化或工藝優(yōu)化，采用菌種強化和工藝優(yōu)化雙管齊下的方法，其效果最好，并且這種方法也適合醬香型白酒釀造企業(yè)的生產(chǎn)實際，容易被生產(chǎn)應(yīng)用落地；另外，菌種強化的方式的效果要優(yōu)于工藝優(yōu)化的方法，這可能是浸提液在中國白酒特殊的固態(tài)蒸餾工藝下，遷移至基酒中的效率不高的緣故。

2.5 基酒質(zhì)量對比結(jié)果

由圖5可知，采用菌種強化工藝優(yōu)化的方法以及二者相結(jié)合的方法對于基酒的曲香得分均有提高效果，說明基酒中的四甲基吡嗪與“曲香”特征存在相關(guān)性。本研究重點關(guān)注采用菌種強化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法釀制的基酒，其曲香特征和整體風(fēng)格都要略優(yōu)于傳統(tǒng)工藝釀制的對照基酒；而在干凈度特征上，相對于對照基酒則有所降低。這可能是由于頭尾酒不僅提取出了菌劑中的四甲基吡嗪，同時也提取出了其他醇溶性香氣物質(zhì)，這些香氣物質(zhì)也在串蒸過程中遷移到了基酒中所致。采用兩種不同工藝釀造出的基酒的整體感官差異不大，經(jīng)過感官評定，兩類基酒的質(zhì)量等級均被評為二級。所以，本研究認為利用菌種強化結(jié)合工藝優(yōu)化這種方法，對于基酒的曲香和干凈度會有一定影響，但對于基酒的整體質(zhì)量影響不大。

圖5 不同工藝釀造的基酒感官得分雷達圖Fig.5 Radar chart of sensory scores of base liquor brewed by different processes

3 結(jié)論

本研究針對醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的實際生產(chǎn)工藝，創(chuàng)新性的引入了發(fā)酵階段的菌種強化和蒸餾烤酒階段的工藝優(yōu)化的雙管齊下的方法，通過疊加作用進一步提升醬香型白酒基酒中的四甲基吡嗪的含量。結(jié)果表明，單一采用菌種強化的方法能夠?qū)⒒浦兴募谆拎汉刻岣?60.71%；單一采用工藝優(yōu)化的方法能夠?qū)⒒浦兴募谆拎汉刻岣?5.75%；而采用菌種強化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法能夠?qū)⒒浦兴募谆拎汉刻嵘?02.75%。菌種強化和工藝優(yōu)化相結(jié)合的方法對于提升基酒中四甲基吡嗪含量的效果最好，且對基酒質(zhì)量影響不大。該技術(shù)生產(chǎn)操作簡便，適于企業(yè)落地應(yīng)用。