侯宇豪，常 霞，謝秋濤，袁洪燕，劉思含，宋 瑩，李高陽(yáng)

（1.湖南大學(xué) 研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

小麥胚芽是小麥制粉過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，其中高含量的蛋白質(zhì)以及不飽和脂肪酸讓小麥胚芽可作為蛋白補(bǔ)充劑與糧油制品的理想原料[1-4]。但由于小麥胚芽中存在高活性的內(nèi)源脂肪氧化酶、高含量的抗?fàn)I養(yǎng)因子以及高水分活度[5-6]，使得小麥胚芽難以直接作為食品加工原料得到有效利用，往往被作為飼料或廢料處理[7-8]。發(fā)酵作為改良食品理化及加工特性的有效方法，在小麥胚芽上也得到了成功應(yīng)用。發(fā)酵后的小麥胚芽中的植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量大大減少，脂肪酶和脂肪氧化酶的活性也得到顯著抑制[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，小麥胚芽中的活性肽、多酚等功能活性物質(zhì)的含量也在發(fā)酵后顯著增加，具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤等生理功能[10-12]。其中2,6-二甲氧基對(duì)苯醌（2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone，2,6-DMBQ）作為發(fā)酵小麥胚芽中主要的抗腫瘤活性成分而受到廣泛關(guān)注。

2,6-DMBQ來(lái)源于小麥胚芽細(xì)胞內(nèi)的水溶性氫醌糖苷。在發(fā)酵過(guò)程中，氫醌糖苷的糖苷鍵受微生物分泌的β-葡萄糖苷酶的作用斷裂，并在過(guò)氧化氫酶的作用下生成2,6-DMBQ[13]。HIDVéGI M等[14]在20世紀(jì)90年代利用面包酵母發(fā)酵小麥胚芽，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物加工后得到發(fā)酵小麥胚芽提取物并命名為Avemar。在后續(xù)的研究中，Avemar的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力的功效得到廣泛證實(shí)[15-16]，但對(duì)于Avemar具體的發(fā)酵工藝與發(fā)酵菌種卻鮮有報(bào)道。國(guó)內(nèi)學(xué)者經(jīng)秀等[17]和國(guó)外學(xué)者RIZZELLO C G等[18]分別以酵母菌和乳酸菌為受試菌種進(jìn)行產(chǎn)2,6-DMBQ菌種的篩選，最終得出高溫釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為最適發(fā)酵菌種，但是后續(xù)并沒(méi)有對(duì)兩種菌種產(chǎn)2,6-DMBQ的能力進(jìn)行進(jìn)一步比較。

本研究以小麥胚芽為原料，2,6-DMBQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從3株菌株中篩選最優(yōu)發(fā)酵菌種，并考察3種原料前處理方式對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響。在此基礎(chǔ)上，探究菌種添加量、料液比、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)發(fā)酵工藝因素對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，并通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定最適合發(fā)酵工藝組合，旨在為發(fā)酵小麥胚芽資源進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

小麥胚芽：市售。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：實(shí)驗(yàn)室分離保存；高溫釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、低糖面包酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 試劑

甲醇、氯化鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)上海試劑有限公司；2,6-二甲氧基對(duì)苯醌標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%）：梯希愛(ài)上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extractpeptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RS-FS1401型多功能粉碎機(jī)：合肥榮事達(dá)小家電有限公司；LHS-250HC-11型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA 124S型精密分析天平：廣州市授科儀器科技有限公司；Avanti J-26xp型高速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LDZM-80L-III型滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LGJ-25G冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；M3-L233B微波爐：廣東美的微波爐制造有限公司；Waters ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色譜系統(tǒng)：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 小麥胚芽發(fā)酵工藝及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

粉碎：將小麥胚芽粉碎后，過(guò)60目篩。

滅菌：將小麥胚芽粉與超純水按質(zhì)量比1∶3充分混勻后在121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌15 min。

預(yù)處理：將滅完菌的小麥胚芽與超純水按照質(zhì)量比1∶10再次混勻，按照后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行不同處理。

菌種活化、接種：將植物乳桿菌接入MRS肉湯，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取200 μL培養(yǎng)液接入MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2代后，按后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行接種。高溫釀酒酵母和低糖面包酵母在37 ℃溫水中活化10 min后取200 μL接入YEPD培養(yǎng)基，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化培養(yǎng)2代后，按后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行接種。

發(fā)酵：按照后續(xù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵菌種的篩選

植物乳桿菌：用無(wú)菌生理鹽水將活化后的植物乳桿菌菌體濃度調(diào)節(jié)至1×104CFU/mL，按菌種添加量1∶6（菌液與麥胚質(zhì)量比，g∶g）添加到料液比為1∶15（麥胚與水質(zhì)量比，g∶g）的小麥胚芽發(fā)酵基液中，37 ℃條件下發(fā)酵24 h[19]。

酵母：用無(wú)菌生理鹽水將活化后的高溫釀酒酵母、低糖面包酵母的菌體濃度調(diào)節(jié)至1×104CFU/mL，按菌種添加量1∶6分別添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h[17]。

取發(fā)酵液測(cè)定2,6-DMBQ產(chǎn)量，比較3株菌產(chǎn)2,6-DMBQ的能力，確定最適發(fā)酵菌種。

1.3.3 不同預(yù)處理方式對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

在確定最適發(fā)酵菌種的基礎(chǔ)上，以未作處理的小麥胚芽為空白對(duì)照，根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別采用高溫（95 ℃，30 min）、微波（700 W，5 min）、超聲（功率100%，30 min）3種方法對(duì)小麥胚芽進(jìn)行預(yù)處理[20]。用無(wú)菌生理鹽水將活化后的最適菌種的菌體濃度調(diào)節(jié)至1×104CFU/mL，按菌種添加量1∶6添加到料液比為1∶15的小麥胚芽發(fā)酵基液中，28 ℃條件下發(fā)酵24 h。測(cè)定發(fā)酵液中2,6-DMBQ產(chǎn)量，以探究不同的預(yù)處理?xiàng)l件下是否有助于2,6-DMBQ產(chǎn)量的增加，確定最適預(yù)處理方式。

1.3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在確定最適發(fā)酵菌種和預(yù)處理方式后進(jìn)行發(fā)酵條件的研究，固定發(fā)酵條件為：菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度28 ℃，在此基礎(chǔ)上，依次考察菌種添加量（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、發(fā)酵溫度（18 ℃、23 ℃、28 ℃、33 ℃、38 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（18 h、24 h、30 h、36 h、42 h）對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，確定各因素的最適條件以進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以2,6-DMBQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取菌種添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定最佳發(fā)酵條件組合，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵小麥胚芽產(chǎn)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone production by fermented wheat germ

1.3.6 2,6-DMBQ產(chǎn)量的測(cè)定

樣品的處理：將發(fā)酵液在8000×g、4℃條件下離心15min，取上清液冷凍干燥，然后加入20 mL甲醇于凍干物料中進(jìn)行浸提，超聲處理（功率100%，30 min）后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾制得待測(cè)樣品液進(jìn)行測(cè)定。

參照經(jīng)秀等[17]的方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）法測(cè)定2,6-DMBQ產(chǎn)量。UPLC條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇∶水=20∶80（V/V），流速0.2 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量0.2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)288 nm。以2,6-DMBQ的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制2,6-DMBQ標(biāo)準(zhǔn)曲線。2,6-DMBQ標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=48 102x-33 772，R2=0.999 4，說(shuō)明2,6-DMBQ在1～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可用于2,6-DMBQ的定量。根據(jù)2,6-DMBQ標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用Excel 2019軟件整理數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行繪圖與方差分析（analysis of variance，ANOVA）顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），使用SPSS 22軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，所有試驗(yàn)指標(biāo)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的篩選

發(fā)酵菌種產(chǎn)2,6-DMBQ的能力與菌種產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶緊密相關(guān)。先前的研究表明，面包酵母[14]、釀酒酵母[21]以及植物乳桿菌[18]均可產(chǎn)生高活性的β-葡萄糖苷酶，并能有效轉(zhuǎn)化小麥胚芽中的氫醌糖苷生成2,6-DMBQ，但是并未有研究對(duì)這幾種類型的菌株產(chǎn)2,6-DMBQ的能力進(jìn)行統(tǒng)一比較。因此，在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇1株乳酸菌和2株酵母菌進(jìn)行產(chǎn)2,6-DMBQ能力的比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同發(fā)酵菌株對(duì)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different fermentation strains on 2,6-dimethoxy-ρbenzoquinone yield

由圖1可知，低糖面包酵母產(chǎn)2,6-DMBQ的能力[（100.81±8.33）μg/g]顯著高于植物乳桿菌[（62.22±7.61）μg/g]和高溫釀酒酵母[（73.95±6.61）μg/g]（P＜0.05），說(shuō)明3株菌種在各自最適生長(zhǎng)溫度下，相同菌體濃度發(fā)酵相同時(shí)間，低糖面包酵母相對(duì)于植物乳桿菌與高溫釀酒酵母具有更強(qiáng)的產(chǎn)2,6-DMBQ的能力，因此，選擇低糖面包酵母作為后續(xù)試驗(yàn)的發(fā)酵菌種。

2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

2,6-DMBQ的前體物質(zhì)氫醌糖苷主要存在于小麥胚芽細(xì)胞內(nèi)部[22]，常溫條件下直接用水浸提的效率緩慢。因此，在發(fā)酵前需要對(duì)小麥胚芽進(jìn)行預(yù)處理，破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使小麥胚芽中的氫醌糖苷盡可能被發(fā)酵菌種利用。常見(jiàn)的細(xì)胞破壁方法有超聲法[23]、微波法[24]、高溫法[20]等。因此，選擇上述3種預(yù)處理方法探究其對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同預(yù)處理方式對(duì)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different pretreatment methods on 2,6-dimethoxy-ρbenzoquinone yield

由圖2可知，與空白對(duì)照相比，3種預(yù)處理方式均能顯著提高2,6-DMBQ的產(chǎn)量（P＜0.05），且小麥胚芽在發(fā)酵前經(jīng)超聲處理后，2,6-DMBQ產(chǎn)量[（418.77±3.38）μg/g]顯著高于微波處理[（208.78±8.01）μg/g]和高溫處理方式[（201.48±10.66）μg/g]（P＜0.05）。分析原因可能是超聲處理時(shí)產(chǎn)生的空穴效應(yīng)可以破壞小麥胚芽的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而釋放出更多的氫醌糖苷于發(fā)酵基液中，進(jìn)而增加2,6-DMBQ的產(chǎn)量，而高溫處理與微波處理對(duì)于小麥胚芽的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞程度相對(duì)較弱[23]。因此，選擇超聲處理作為小麥胚芽發(fā)酵前的預(yù)處理方式。

2.3 低糖面包酵母產(chǎn)2,6-DMBQ發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 菌種添加量對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

由圖3可知，隨著菌種添加量的減少，2,6-DMBQ產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)菌種添加量為1∶8時(shí)，2,6-DMBQ產(chǎn)量最高為（447.15±12.18）μg/g，分析原因可能是菌種添加過(guò)多使得菌體之間產(chǎn)生了營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，而菌種添加過(guò)少菌體無(wú)法充分利用底物進(jìn)行產(chǎn)出。因此，確定最適菌種添加量為1∶8。

圖3 菌種添加量對(duì)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of strain addition on 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone yield

2.3.2 料液比對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

圖4 料液比對(duì)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone yield

由圖4可知，2,6-DMBQ的產(chǎn)量隨著料液比的減少呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，2,6-DMBQ產(chǎn)量最高為（478.71±5.41）μg/g。料液比是指小麥胚芽與水的質(zhì)量比，其中水的比例越高，物料被稀釋，因此單位體積發(fā)酵液中的2,6-DMBQ產(chǎn)量越低，而水的比例過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致小麥胚芽粉末因吸水不充分而結(jié)塊，不利于酵母利用底物。因此，確定最適料液比為1∶10。

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on 2,6-dimethoxy-ρbenzoquinone yield

由圖5可知，2,6-DMBQ產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度的升高先增大后減少，當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，2,6-DMBQ產(chǎn)量最高為（470.97±8.28）μg/g。酵母菌最適生長(zhǎng)溫度通常為28 ℃左右[25]，溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于酵母菌的生長(zhǎng)，因此，確定最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of fermentation time on 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone yield

由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，2,6-DMBQ產(chǎn)量呈先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵36 h時(shí)，2,6-DMBQ產(chǎn)量最高為（631.92±16.30）μg/g。分析原因可能是發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，酵母菌無(wú)法充分利用底物，而發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酵母中的醌氧化還原酶會(huì)將2,6-DMBQ還原為氫醌[21]。因此，確定最適發(fā)酵時(shí)間為36 h。

2.4 低糖面包酵母產(chǎn)2,6-DMBQ發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以2,6-DMBQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取菌種添加量（A）、料液比（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）為考察因素進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 低糖面包酵母產(chǎn)2,6-二甲氧基對(duì)苯醌發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of low-sugar baker's yeast for 2,6-dimethoxy-ρ-benzoquinone production

續(xù)表

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，6號(hào)試驗(yàn)組合（A2B3C1D2）2,6-DMBQ產(chǎn)量最高，為（728.21±15.74）μg/g，根據(jù)極差分析可知，影響2,6-DMBQ產(chǎn)量的因素主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，即菌種添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞料液比；最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A2B3C3D2，即菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時(shí)間42 h、發(fā)酵溫度28 ℃。由表3可知，菌種添加量對(duì)2,6-DMBQ產(chǎn)量的影響顯著（P＜0.05），方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。在最優(yōu)條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，2,6-DMBQ的平均產(chǎn)量為（765.23±9.11）μg/g，高于試驗(yàn)組。因此，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝組合為A2B3C3D2，即菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵時(shí)間42 h、發(fā)酵溫度28 ℃。

3 結(jié)論

以2,6-DMBQ產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出最適發(fā)酵菌株為低糖面包酵母，確定超聲處理為最佳原料前處理方式，在此基礎(chǔ)上通過(guò)單因素與正交試驗(yàn)對(duì)低糖面包酵母發(fā)酵小麥胚芽產(chǎn)2,6-DMBQ的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為：菌種添加量1∶6、料液比1∶15、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間42 h，在此優(yōu)化條件下，2,6-DMBQ平均產(chǎn)量為（765.23±9.11）μg/g。試驗(yàn)初步探究了小麥胚芽發(fā)酵產(chǎn)2,6-DMBQ的原料前處理方法、發(fā)酵菌株及發(fā)酵工藝，為發(fā)酵小麥胚芽在保健食品、特醫(yī)食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)。