孫 科，耿鳳英，于秋菊，王 鋒

（徐州生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥品食品學(xué)院，江蘇 徐州 221006）

牛蒡（Arctium lappcL.）為菊科（Compositae）牛蒡?qū)伲⊿ynurus）植物，是一種典型的藥食同源植物[1]，含有蛋白質(zhì)、菊糖、多種維生素和礦物質(zhì)，其中胡羅素含量是胡蘿卜的150倍，蛋白質(zhì)和鈣含量是根莖類植物之冠，具有降血壓、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等作用[2]。中國牛蒡產(chǎn)量居世界第一[3]，而徐州市豐縣年產(chǎn)牛蒡28萬t，年銷售收入20億元，因此，徐州豐縣有“牛蒡之鄉(xiāng)”之稱[4]。

鉀是植物生長需要量最大的三大類必需營養(yǎng)元素之一，地殼中鉀元素含量約占2.47%，但是土壤中92%～98%的鉀是以礦物質(zhì)鉀形式存在的[5]，是植物不能直接利用的。我國是一個土壤缺鉀嚴(yán)重的國家，目前約有0.3億hm2土地缺鉀[6]，并且我國鉀肥的儲量較小、開發(fā)難度大，每年需要大量進(jìn)口鉀肥。以江蘇為例，江蘇每年大約需要鉀肥10萬t，但江蘇自給的鉀肥僅有0.15萬t，其余需要從俄羅斯等國進(jìn)口[7]。轉(zhuǎn)化土壤中的無效鉀，提高土壤中有效鉀含量，是解決我國土壤缺鉀的一個有效途徑。土壤中存在一些通過自身的代謝作用，能夠把無效鉀轉(zhuǎn)化為植物可以直接吸收利用的有效鉀的微生物，稱其為解鉀菌（postassium bacteria）。60多年前，前蘇聯(lián)科學(xué)家亞歷山大羅夫[8]第一次發(fā)現(xiàn)硅酸鹽細(xì)菌以來，解鉀菌的研究從未間斷過并取得一定的進(jìn)展。盛下放等[9]分離篩選到一株高效的解鉀菌NBT，解鉀率達(dá)到226.0%，大田試驗(yàn)顯示對棉花有一定的增產(chǎn)作用；SUGUMARAN P等[10]篩選得到一株解鉀菌，可使土壤中有效鉀質(zhì)量濃度達(dá)到99.60 mg/kg，植物干質(zhì)量增加125%。

目前，關(guān)于解鉀菌報道較多，但解鉀菌的絕對解鉀量仍然不高，針對牛蒡?qū)Ｓ媒忖浘难芯窟€沒有報道。因此，本研究從牛蒡根際土壤中分離篩選解鉀菌，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行菌種鑒定，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對其解鉀條件進(jìn)行優(yōu)化，最后，通過牛蒡盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證其促生能力，為牛蒡?qū)Ｓ糜袡C(jī)肥提供解鉀微生物菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

通過5點(diǎn)取樣法在徐州市豐縣牛蒡標(biāo)準(zhǔn)化種植基地采集牛蒡根際5～15 cm深土壤樣本，采集后混勻裝入無菌牛皮紙袋密封，貼上標(biāo)簽，4 ℃保存。

1.1.2 試劑

FeCl3、CaCO3、MgSO4·7H2O、Na2HPO4（均為分析純）：格里斯（天津）醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司；酵母浸膏、蔗糖、瓊脂（均為生化試劑）：北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；鉀長石粉（K2O≥10%）：江西佳利生化高科有限公司；Taq聚合酶（2.5 U/μL）、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基[11]：FeCl30.005 g/L，CaCO30.1 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，蔗糖5.0 g/L，鉀長石粉（去離子水浸泡過夜，反復(fù)沖洗8～10次，陰干，去除可溶性鉀）1.0 g/L，瓊脂18 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基[12]：NaCl 0.1 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，CaCO31.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖10 g/L，酵母膏0.5 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉20 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基[13]：NaCl 0.1 g/L，CaCO31.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，Na2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖10.0 g/L，酵母膏0.5 g/L，鉀長石粉（去離子水浸泡過夜，反復(fù)沖洗8～10次，陰干，去除可溶性鉀）10.0 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

改良LB液體培養(yǎng)基[14]：NaCl 10.0 g/L，L-色氨酸0.5 g/L，酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，雙蒸水1 000 mL；pH 6.8～7.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ-124/85S半微量電子天平：上海諾宣科學(xué)儀器有限公司；HNY-200B恒溫?fù)u床：上海喬躍電子科技有限公司；LH-PYX3M生化培養(yǎng)箱：常州金南儀器制造有限公司；VD-850臺式超凈工作臺：杭州旭清科技有限公司；MG96G型基因擴(kuò)增儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；XW-80A漩渦混合器：廣森實(shí)驗(yàn)器材有限公司；TDZ4離心機(jī)：青島諾凱達(dá)機(jī)械制造有限公司；UV2800S紫外分光光度計：上海力辰儀器科技有限公司；ICP-5000電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductivelycoupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES）儀：北京吉天儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡根際土壤中解鉀菌的初篩

稱取10 g牛蒡根際土壤，加入90 mL無菌去離子水中充分振蕩，采用10倍梯度稀釋至10-6，制備土壤懸液。取稀釋度為10-4、10-5、10-6的土壤懸液各100 μL均勻涂布于初篩培養(yǎng)基，每個濃度做3個平行，30 ℃倒置培養(yǎng)60 h。挑選菌落直徑大、圓形、表面濕潤的單菌落進(jìn)行劃線純化，直至顯微觀察得到純菌種。

1.3.2 牛蒡根際土壤中解鉀菌的復(fù)篩

（1）有效鉀含量的測定

挑取初篩解鉀菌菌落接種到種子培養(yǎng)基，在37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至菌體濃為108CFU/mL作為種子液。按5%（V/V）的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)6 d，以等量滅菌的種子液為對照組，每個菌落做3個平行。采用過氧化氫灰化法處理發(fā)酵液，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）儀測定處理后發(fā)酵液中鉀離子含量[15]，并計算有效鉀的相對增加率，其計算公式如下：

a=（ρ1-ρ0）/×100%[15]

式中：a：有效鉀增加率，%；ρ1：試驗(yàn)組發(fā)酵液中有效鉀含量，mg/L；ρ0：對照組發(fā)酵液中有效鉀含量，mg/L。

（2）解鉀菌分泌吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）能力的測定

挑取初篩解鉀菌菌落接種到改良的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48h。取發(fā)酵液，10000r/min離心20 min，取上清液50 μL加入等體積Sackowchi's顯色劑，倒在白瓷板上避光觀察，30 min出現(xiàn)粉紅色為陽性，表示該菌株可以分泌吲哚乙酸（IAA）[16]。以接種滅活解鉀菌培養(yǎng)液為對照，取上述陽性菌株混合液，測定波長530 nm處的吸光度值，計算陽性解鉀菌株分泌IAA的量[17]。

1.3.3 解鉀菌株的鑒定

形態(tài)觀察[18]：借助顯微鏡進(jìn)行菌株的形態(tài)特征觀察和菌落特征觀察。

生理生化特性鑒定：參考文獻(xiàn)[18-19]進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

16S rDNA序列分析[20]：利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取解鉀菌株的DNA，以其為模板，使用通用引物F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴(kuò)增16S rDNA基因。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：10×PCR緩沖液2 μL，模板DNA 20 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs）（10 mmo/L）0.45 μL，上、下游引物（20 μg/L）各0.25 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，加雙蒸水（ddH2O）至終體積。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min。回收瓊脂糖凝膠PCR克隆片段連接到T載體，送至南京世和基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA，利用Mega 6軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 解鉀菌株解鉀條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

考察初始pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發(fā)酵溫度（25 ℃、26 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%（V/V））、培養(yǎng)時間（12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h）對可溶性鉀含量的影響，每個試驗(yàn)做3個平行。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵溫度（X1）、初始pH值（X2）、接種量（X3）和發(fā)酵時間（X4）為自變量，以可溶性鉀含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計因素與水平見表1。

表1 解鉀條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for potassium-dissolving conditions optimization

1.3.5 盆栽試驗(yàn)

對解鉀能力優(yōu)化后的菌株進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，選用0～25 cm耕層的土壤，將土壤風(fēng)干粉碎后，裝入花盆中（底直徑25 cm，高29 cm），每盆裝3 kg，共裝20盆。將20盆土壤隨機(jī)分成2組（實(shí)驗(yàn)組和對照組）。實(shí)驗(yàn)組將發(fā)酵原液加入適量無菌水稀釋，把牛蒡種子浸入稀釋液中1～2 h，陰干后播種，剩余的稀釋液播種時一起施入土壤。對照組用等量的無菌水處理。30 d后測量牛蒡的株高、莖的直徑、葉片數(shù)和地上部分鮮質(zhì)量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用軟件Design Expert 8.0.6[21]對試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解鉀菌篩選

通過初篩共獲得36株具有解鉀能力的菌株。挑選直徑較大、圓形、表面濕潤的9個菌落進(jìn)行復(fù)篩，對菌株進(jìn)行編號，分別為PB-1、PB-2、PB-3、PB-4、PB-5、PB-6、PB-7、PB-8和PB-9，測定每株解鉀菌發(fā)酵液中的有效鉀含量，同時測定IAA產(chǎn)量，每株解鉀菌做3個平行，結(jié)果分別見表2和表3。

表2 9株菌株解鉀率的測定結(jié)果Table 2 Determination results of potassium-dissolving rates of 9 strains

表3 9株菌株產(chǎn)泌吲哚乙酸能力的測定結(jié)果Table 3 Determination results of indole-3-acetic acid production capacity of 9 strains

由表2可知，9株解鉀菌解鉀率較高，可溶性鉀的增加率在116%～136%之間，其中菌株P(guān)B-9發(fā)酵液中可溶性鉀的增加率最高，達(dá)到136%。比李新新等[22]篩選的類芽孢桿菌屬解鉀菌G4可溶性鉀增加率（127.6%）、李海龍等[23]分離篩選出的芽孢桿菌QL21的可溶性鉀增加率（25.1%）高。由表3可知，9株解鉀菌在改良LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，有7株菌株可以產(chǎn)IAA，其中菌株P(guān)B-9產(chǎn)IAA的能力最強(qiáng)，IAA產(chǎn)量達(dá)到38.64 mg/L。因此，選取菌株P(guān)B-9為研究對象，進(jìn)行下一步研究。

2.2 解磷菌PB-9的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株P(guān)B-9在種子固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1a可知，菌株P(guān)B-9的菌落呈圓形，不透明，乳白色，表明光滑、隆起，邊緣濕潤。由圖1b可知，菌株P(guān)B-9革蘭氏染色陽性，多呈棒狀，單個或呈短鏈排列，大小約（1.2～1.5）μm×（2.0～4.0）μm，有芽孢、菌毛，有鞭毛，能運(yùn)動。

圖1 菌株P(guān)B-9的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain PB-9

2.2.2 生理生化特征鑒定

表4 菌株P(guān)B-9的生理生化特性Table 4 Biophysical and biochemical characteristics of strain PB-9

由表4可知，菌株P(guān)B-9的生理生化特性與巨大芽孢桿菌的生理生化特性相同，結(jié)合菌落特征和顯微特征，初步鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megateriums）。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

由圖2可知，菌株P(guān)B-9與巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）（GenBank：DQ462195）聚于一支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株P(guān)B-9的菌落特征、顯微觀察特征和生理生化特性，將菌株P(guān)B-9鑒定為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）。對于解鉀菌的系統(tǒng)發(fā)育分類地位，得到國際公認(rèn)的菌種包括：土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）[24]、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）[25]、膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilagionsus）[26]。但是，隨著國內(nèi)外研究者對解鉀菌的深入研究，目前解鉀菌的種類出現(xiàn)了多樣化趨勢：陳宇豐等[27]從香蕉根際土壤中分離篩選出一株高效解鉀菌，經(jīng)鑒定為陜西鏈霉菌（Streptomyeces shaanxiensis）；張朝輝等[28]從烤煙根際分離得到一株解鉀菌K03，通過形態(tài)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定為阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）。姜霽航等[29]從蘋果根際土壤分離得到5株解鉀能力較強(qiáng)的菌株，經(jīng)鑒定1株為不動桿菌屬（Acinetobactersp.）、3株為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）、1株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株P(guān)B-9的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain PB-9 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 巨大芽孢桿菌PB-9的解鉀條件優(yōu)化

2.3.1 解鉀條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，可溶性鉀含量隨著發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為31 ℃時，可溶性鉀含量（36.28 mg/L）最大，表明31 ℃是菌株P(guān)B-9解鉀的最適溫度。原因可能是溫度會影響菌株P(guān)B-9細(xì)胞內(nèi)酶的活性，溫度31 ℃時菌株P(guān)B-9細(xì)胞內(nèi)酶活性最高，所以菌株解鉀能力最強(qiáng)。可溶性鉀含量隨著初始pH值的升高呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)初始pH值為6.0時，可溶性鉀含量（33.16 mg/L）最大，表明初始pH值6.0是菌株P(guān)B-9解鉀的最適初始pH值。原因可能是環(huán)境中的pH值會影響菌株細(xì)胞內(nèi)的pH值，菌株細(xì)胞內(nèi)的pH值也會影響酶的催化活性，從而影響菌株的解鉀能力?？扇苄遭浐侩S著接種量的增大呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)接種量為7.0%時，可溶性鉀含量（36.19 mg/L）最大，表明菌株P(guān)B-9解鉀的最佳接種量為7.0%。原因可能是當(dāng)接種量過小時，達(dá)到最大解鉀能力需要時間較長，當(dāng)接種量較大時，菌種之間形成競爭過于激烈，同樣不利于解鉀?？扇苄遭浐侩S著發(fā)酵時間的延長呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間為55 h時，可溶性鉀含量（36.16 mg/L）最大，這與菌種本身的遺傳特性及培養(yǎng)基豐富程度等因素有關(guān)。

圖3 不同培養(yǎng)條件對菌株P(guān)B-9解鉀能力的影響Fig.3 Effect of different culture conditions on potassium-solubilizing ability of strain PB-9

2.3.2 解鉀條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以發(fā)酵溫度（X1）、初始pH值（X2）、接種量（X3）和發(fā)酵時間（X4）為自變量，以可溶性鉀含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行中心組合響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見表5，方差分析見表6。

表5 菌株P(guān)B-9解鉀條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 5 Results and analysis of response surface tests for potassium-dissolving conditions optimization

對表6結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程如下：

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test results

由表7可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型可靠。一次項及二次項均對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。對以上回歸方程求解可得出：X1=30.86、X2=6.76、X3=6.58、X4=52.61。也就是當(dāng)發(fā)酵溫度為30.86 ℃、初始pH值為6.76、接種量為6.58%和發(fā)酵時間為52.61 h，可溶性鉀含量最高。結(jié)合實(shí)際情況，最終確定最優(yōu)的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31 ℃、初始pH值6.8、接種量6.6%和發(fā)酵時間53 h，可溶性鉀含量理論值36.28 mg/L，增長率136.24%。

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在最優(yōu)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果可溶性鉀含量實(shí)際值為38.46 mg/L，與理論值相差較小。由此可以看出預(yù)測模型可以很好預(yù)測菌株P(guān)B-9實(shí)際發(fā)酵情況。

2.4 盆栽試驗(yàn)結(jié)果

盆內(nèi)種植牛蒡，一組盆內(nèi)接種PB-9菌液，另一組為等量清水（CK）。30 d后測定牛蒡的生長參數(shù)，結(jié)果見表7。

表7 菌株P(guān)B-9對牛蒡生長的影響Table 7 Effect of strain PB-9 on the growth of burdock

由表7可知，與對照（CK）組相比，牛蒡生長的各項參數(shù)除了莖直徑差異不顯著（P＞0.05）外，其他各項指標(biāo)都有顯著差異（P＜0.05）。接菌組牛蒡的株高、葉片數(shù)、地上部分鮮質(zhì)量比CK組分別高25.78%、28.48%、26.54%。所以，菌株P(guān)B-9可以明顯的促進(jìn)牛蒡的生長。原因主要是菌株P(guān)B-9除了具有較強(qiáng)的解鉀作用，還可以分泌IAA，并且能降低土壤pH值抑制有害微生物生長和提高土壤中可溶性鉀的含量。

3 結(jié)論

本研究從徐州豐縣牛蒡種植標(biāo)準(zhǔn)區(qū)牛蒡土壤中初篩出具有較強(qiáng)解鉀能力微生物9株，通過測定發(fā)酵液中可溶性鉀含量及IAA生產(chǎn)能力，復(fù)篩選出1株解鉀能力和產(chǎn)IAA能力都是最強(qiáng)的菌株P(guān)B-9。利用形態(tài)觀察、生理生化特性測定和16S rDNA基因序列分析，鑒定菌株P(guān)B-9為巨大芽孢桿菌（Bacillus megateriums）。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定菌株P(guān)B-9的最優(yōu)解鉀條件為培養(yǎng)溫度31 ℃、初始pH值6.8、接種量6.6%和培養(yǎng)時間為53 h，在此最優(yōu)條件下，可溶性鉀含量為38.46mg/L，增長率為136.24%。最后，通過牛蒡盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證菌株P(guān)B-9促生能力，結(jié)果顯示接菌組牛蒡的株高、葉片數(shù)和地上部分鮮質(zhì)量比CK組分別高25.78%、28.48%、26.54%，對牛蒡的生長具有顯著的促進(jìn)作用（P＜0.05）。