李曉娟，孟 君，徐 瑩，張 凱，唐 雪

（1.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南 株洲 412000；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

皮膚衰老是指皮膚衰老性損傷，使其對機體的防護能力和調(diào)節(jié)能力減退，導致不能適應內(nèi)外環(huán)境的變化，出現(xiàn)顏色、色澤、形態(tài)、質感等外觀整體狀況的改變[1]。紫外線照射、遺傳因素和生活習慣是引起皮膚衰老的主要因素，具體表現(xiàn)為皮膚含水率降低、膠原蛋白流失和彈性蛋白減少，導致皮膚干燥、松弛和皺紋產(chǎn)生。目前，最受認可的衰老假說是自由基衰老學說，該學說認為衰老是由各種活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在體內(nèi)積累，加速氧化損傷核酸、蛋白質和生物膜系統(tǒng)的結果[2]。正常狀態(tài)下，機體內(nèi)促氧化作用與抗氧化防御處于動態(tài)平衡，使自由基維持在生理水平[3]。當機體處于氧化應激狀態(tài)時，體內(nèi)的抗氧化酶活性降低，還原性物質生成減少，使動態(tài)平衡打破，加速皮膚衰老[4]。

荔枝（Litchi chinensisSonn.）是一種廣泛分布亞熱帶地區(qū)的水果，具有口感甘甜、營養(yǎng)豐富、促進皮膚新陳代謝和延緩衰老的功效。研究發(fā)現(xiàn)，荔枝果肉含有豐富的多糖和酚類活性物質，具有抗氧化、抗炎、降血脂和增強免疫力等作用[5-8]。玫瑰（Rosa rugosaThunb.）屬薔薇科植物，花瓣富含維生素、氨基酸和多酚類物質，其中維生素C（vitamin C，VC）含量較高，具有較強的抗氧化、抗炎等生物活性，已被廣泛應用于食品、藥品等領域[9-14]。本研究綜合荔枝和玫瑰這兩種不同藥食原料的營養(yǎng)保健價值，開發(fā)出一款對皮膚具有健康功效的低酒精度果酒，可滿足人們對天然抗氧化飲品的消費需求[15-18]。

該研究前期以新鮮荔枝和玫瑰花瓣為主要原料，輔以蘋果、枸杞和葡萄原酒，應用現(xiàn)代釀酒技術，開發(fā)出了一款具有特殊香氣和醇厚口感的荔枝玫瑰酒。測定了其主要營養(yǎng)物質和活性成分，以D-半乳糖誘導的皮膚衰老小鼠模型作為研究對象，探討了荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚組織理化指標、氧化還原穩(wěn)態(tài)和膠原合成的影響，以期為荔枝玫瑰酒的開發(fā)和推廣提供有價值的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

荔枝玫瑰酒（酒精度為12%vol）：株洲千金藥業(yè)股份有限公司。

60只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）雄鼠[5周齡，（29.75±1.35）g]：上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼喂于江南大學實驗動物中心。飼養(yǎng)條件為光照周期12 h（8：00～20：00），恒溫（23±2）℃，恒濕（60±5）%。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、沒食子酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、單寧酸、甲醇、乙醚、抗壞血酸、草酸、亞硫酸鈉、鉬酸胺、對苯二酚、磷酸二氫鉀（均為分析純）、蘆?。兌龋?5%）：國藥集團化學試劑有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、蛋白質羰基（protein carbonyl，PC）試劑盒：南京建成生物研究所；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術有限公司；魯米諾、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES）、辣根過氧化物酶、鄰苯二甲醛、N-乙基順丁烯二酰亞胺：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Trizol：上海生工生物工程股份有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）、RNase Inhibitor、M-MLV逆轉錄酶：美國ThermoFisher科技公司；SYBR Green Master Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

NexION 350D電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS）儀：美國PE公司；BioTek Epoch全波長酶標儀：美國Biotek公司；Agilent 1100液相色譜儀：美國Agilent公司；UV2300紫外分光光度計：中國上海天美儀器有限公司；5804R離心機：德國Eppendorf公司；CFX96 Touch實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-fluorescence quantitative，polymerase chain reaction，RTFQ PCR）儀：美國Bio-rad公司；One Drop spectrophotometer OD-1000：南京五義科技有限公司；ETC811PCR擴增儀：東勝興業(yè)科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 荔枝玫瑰酒營養(yǎng)成分分析

總糖與還原糖含量測定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中斐林試劑滴定法；蛋白質含量測定：采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法；粗脂肪含量測定：采用GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法；總多酚含量測定：采用福林-酚（Folin-Ciocaleu）法[19]；總黃酮含量測定：采用NaNO2-Al（NO3）3比色法（以蘆丁為標準品）[20]；單寧含量測定：采用Folin-Ciocaleu法（以單寧酸為標準品）[21]。

維生素A、E含量測定：采用GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測定》中反相高效液相色譜法；維生素B1含量測定：采用GB 5009.84—2016《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》中高效液相色譜法；維生素B2含量測定：采用GB 5009.85—2016《食品中維生素B2的測定》中高效液相色譜法；維生素B6含量測定：采用GB 5009.154—2016《食品中維生素B6的測定》中高效液相色譜法；維生素C含量測定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中二氯靛酚染料滴定法。

1.3.2 荔枝玫瑰酒皮膚抗氧化功效研究

（1）動物分組

所有實驗操作均按照江南大學動物使用和福利協(xié)會要求進行。60只SPF級ICR雄鼠預飼1周后，小鼠隨機分為6組：正常組（10只）、D-半乳糖處理組（衰老模型，10只）、VC對照組（抗衰老對照，10只）、低劑量荔枝玫瑰酒組（10只）、中劑量荔枝玫瑰酒組（10只）、高劑量荔枝玫瑰酒組（10只）。正常組注射等體積生理鹽水，其余五組頸背部皮下連續(xù)注射D-半乳糖1 200 mg/（kg·d），建立小鼠衰老模型。6周后，荔枝玫瑰酒組分別飼喂含低（11.25 mL/kg體質量）、中（22.50 mL/kg體質量）、高（45.00 mL/kg體質量）劑量荔枝玫瑰酒的飲用水，添加量相當于人體每天攝入75 mL、150 mL和300 mL荔枝玫瑰酒產(chǎn)品。正常組及D-半乳糖處理組飼喂含體積分數(shù)12%乙醇的飲用水，對照組的VC添加量為450 mg/kg體質量。同時，除正常組外，其余各組繼續(xù)給予相同劑量D-半乳糖頸背部皮下注射。所有動物每周一上午10點用天平稱其體質量，自由采食、飲水，12周后采樣分析。

（2）檢測樣品的采集

飼養(yǎng)結束后，小鼠禁食不禁水12 h，用5%硫化鈉涂于小鼠頸背部，脫去絨毛，隨后用清水沖洗，清潔紗布拭干。眼球采血后頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠頸背部皮膚稱質量。皮膚取同一部位0.1 g，加入0.9 mL生理鹽水后用高通量組織研磨器勻漿，4 000 r/min離心10 min后分離上清，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白質含量，放置于-80 ℃冰箱。

（3）皮膚組織理化指標測定

皮膚水分含量測定：取小鼠背部皮膚，去毛清潔后，精密稱其濕質量，隨即將其放入烘箱中，于80 ℃烘干12 h，稱其干質量，干濕質量的差值與濕質量之比即皮膚含水百分率。皮膚羥脯胺酸含量測定：按照HYP試劑盒說明書方法進行測定。皮膚膠原蛋白含量：根據(jù)HYP試劑盒說明書，羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%進行換算。

（4）氧化應激指標測定

活性氧自由基：采用化學發(fā)光法測定[22]。50 μL組織勻漿液與830 μL Krebs-HEPEs緩沖液混合后加入20 μL 3 mg/mL辣根過氧化物酶，放入化學發(fā)光儀避光后立即加入0.1 mL魯米諾溶液后檢測。

總抗氧化能力、丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽、蛋白質羰基：按照相應試劑盒說明書所示方法進行測定。

（5）RNA提取及反轉錄

采用Trizol法[23]提取小鼠頸背部皮膚組織的RNA，并測RNA濃度及RNA的OD260nm/OD280nm值，將OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0范圍的樣品用焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水調(diào)節(jié)質量濃度至1000μg/mL，之后嚴格按照說明書使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成互補脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），逆轉錄好的cDNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（6）實時熒光定量PCR[24]

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-FQ PCR）測定膠原蛋白合成分解相關基因（TGF-β1、MMP-1、MMP-8）及皮膚抗氧化相關基因（β-actin、Gsk-3β、Nrf2、HO-1、NQO-1）的相對表達量。PCR擴增總體系20 μL，其中cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，2×SYB Green Mix 10 μL，雙蒸水6.4 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共循環(huán)40次；72 ℃終末延伸2 min。以β-肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行計算處理，RT-FQ PCR所用引物序列見表1。

表1 RT-FQ PCR所用引物序列Table 1 Primers sequences used in RT-FQ PCR

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

結果均以“平均值±標準差”表示。采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用單因素ANOVA方差分析，Duncan檢驗進行組間比較，顯著水平為P＜0.05。采用GraphPad Prism7.0軟件處理作圖。

2 結果與分析

2.1 荔枝玫瑰酒的營養(yǎng)指標分析

2.1.1 荔枝玫瑰酒的主要營養(yǎng)成分及活性物質分析

表2 荔枝玫瑰酒的主要營養(yǎng)成分及活性物質測定結果Table 2 Determination results of main nutrient components and active substances in litchi rose wine

由表2可知，荔枝玫瑰酒中含有蛋白質2.30 g/L、粗脂肪7.93 g/L、總糖25.60 g/L、還原糖19.71 g/L（占總糖含量的76.95%）。在荔枝玫瑰酒釀造過程中，由于果汁本身以及發(fā)酵過程中微生物及其代謝產(chǎn)物的存在，使荔枝玫瑰酒存在一定量的蛋白質和脂肪，且糖和脂肪含量較低，根據(jù)GB 28050—2011《食品安全國家標準 預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》，荔枝玫瑰酒屬于低糖低脂食品。此外，荔枝玫瑰酒中還含有生物堿6.62 g/L、多酚0.43 g/L、總黃酮0.25 g/L、單寧0.12 g/L、花色苷0.42×10-3g/L，這使果酒具有獨特的香味和色澤。植物多酚是一類具有多種生物學活性的多元酚結構的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖吖娜~、花和果實中，其含量在表皮中尤為豐富[25]。研究表明，多酚類化合物不僅是天然抗炎癥和抗氧化劑的主要來源，而且可作為信號分子調(diào)節(jié)細胞功能和基因表達，具有潛在的保健功效[26]。黃酮類化合是植物和漿果的重要功能成分，可直接捕捉和清除ROS，通過激活體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化的作用[27]。植物單寧是良好的自由基清除劑和脂質過氧化抑制劑，可抑制脂質氧化，阻斷自由基鏈式反應，具有較強的抗氧化能力[28]。這些可能是荔枝玫瑰酒營養(yǎng)價值及抗氧化穩(wěn)定性的主要因素。

2.1.2 荔枝玫瑰酒維生素含量分析

表3 荔枝玫瑰酒中維生素含量測定結果Table 3 Determination results of vitamins content in litchi rose wine

由表3可知，荔枝玫瑰酒以維生素C為主，含量達到3.145 mg/100 mL，其維生素C的含量略高于無花果果酒（3 mg/100 mL）和諾麗果酒（3.02 mg/100 mL）[29-30]。維生素C又稱L-抗壞血酸，作為一種公認的抗氧化物質，可參與體內(nèi)的氧化還原反應、組織膠原蛋白合成、延緩衰老和增強人體免疫功能[31]。果酒中的維生素通常來源于原料果實，荔枝果肉（15 mg/100 g）、玫瑰花瓣（88.93 mg/100 g）富含維生素C[32-33]，但是極易腐敗變質，而普通的釀造工藝會使得維生素大量流失，荔枝玫瑰酒通過對溫度和原料配比的工藝優(yōu)化不僅盡量保留了較豐富的維生素C，而且易于保存運輸，大大提高了荔枝和玫瑰的資源利用率，能夠獲得巨大的經(jīng)濟效益。

通過荔枝玫瑰酒的營養(yǎng)物質與活性成分分析發(fā)現(xiàn)，荔枝玫瑰酒含有豐富的多酚、黃酮類物質、單寧及維生素C等活性成分，分別達到0.43g/L、0.25g/L、0.12g/L和3.145mg/100mL，其多酚含量明顯高于市售常見櫻桃酒（303 μg/mL）和桑椹紅酒（1.659 μg/mL），與赤霞珠含量相近[34-36]。植物多酚、黃酮具有良好的抗氧化功能，能夠直接清除機體內(nèi)自由基，起到延緩衰老的目的。已有研究表明，水果多酚、黃酮類物質可通過抑制氧化應激、減少炎癥、調(diào)控與疾病有關的基因表達等發(fā)揮干預作用[3]；SARIN N B等[37]指出荔枝果肉酚類物質提取物可顯著增加應激性肝損傷小鼠肝細胞內(nèi)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等抗氧化酶的活性，減少線粒體ROS產(chǎn)生，發(fā)揮體內(nèi)抗氧化應激損傷活性。

2.2 荔枝玫瑰酒對小鼠體質量的影響

圖1 荔枝玫瑰酒對小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of litchi rose wine on body mass of mice

由圖1可知，小鼠飼喂12周后，各組體質量增加但均無顯著性差異（P＞0.05），說明飼喂荔枝玫瑰酒對衰老小鼠體質量無顯著影響。

2.3 荔枝玫瑰酒的皮膚抗氧化功效結果分析

2.3.1 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚組織理化指標和氧化還原狀態(tài)的影響

膠原蛋白是皮膚的重要組成成分，是由真皮中的成纖維細胞所分泌的，對維持皮膚的張力起重要作用[38]。活性氧（ROS）是人體能量代謝的副產(chǎn)物，在健康機體內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài)[39]。當機體發(fā)生氧化應激，過剩的ROS在體內(nèi)累計導致氧化損傷，成纖維細胞生長和更新速度減慢，膠原和彈性纖維合成能力下降，使得皮膚膠原蛋白流失，水分含量減少，皮膚衰老[40]。當機體處于衰老狀態(tài)時，體內(nèi)的抗氧化酶活性降低，總抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽（GSH）下降，動態(tài)平衡失調(diào)，導致蛋白質氧化，進一步加速衰老[41]。

圖2 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚理化指標的影響Fig.2 Effect of litchi rose wine on physical and chemical indexes of mice skin

表4 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚氧化還原指標的影響Table 4 Effect of litchi rose wine on redox indexes of mice skin

表5 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚抗氧化酶活性的影響Table 5 Effect of litchi rose wine on antioxidant enzyme activity of mice skin

由圖2、表4及表5可知，與正常組相比，連續(xù)注射D-半乳糖可使小鼠皮膚含水率、羥脯胺酸、膠原蛋白含量顯著降低（P＜0.05），引起皮膚ROS、MDA和PC水平顯著提高（P＜0.05），T-AOC能力、GSH 水平以及抗氧化酶活性（GSH-Px、SOD和CAT）顯著降低（P＜0.05），表明D-半乳糖注射誘導小鼠皮膚衰老和氧化損傷。與之相反，和D-半乳糖處理組相比，飼喂高劑量荔枝玫瑰酒能顯著提高小鼠皮膚含水率、羥脯胺酸和膠原蛋白含量（P＜0.05），降低MDA含量、GSH-Px酶活性，提高GSH含量、SOD和CAT酶活性（P＜0.05），且高劑量荔枝玫瑰酒效果與VC相當。結果表明，一定劑量的荔枝玫瑰酒可改善衰老小鼠皮膚氧化還原穩(wěn)態(tài)，提高抗氧化能力，降低ROS和過氧化產(chǎn)物生成，顯著恢復皮膚含水率、羥脯胺酸和膠原蛋白。

2.3.2 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚膠原蛋白合成分解相關基因表達的影響

膠原蛋白是皮膚中含量最多的一種蛋白質，對于表皮基底層和真皮層的粘附均具有重要作用，使細胞豐滿水盈，賦予皮膚韌性和彈力，是維持皮膚形態(tài)和結構的重要物質。膠原蛋白主要包括Ⅰ型膠原蛋白（85%～90%）和Ⅲ型膠原蛋白（10%～15%）。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，Tgf-β1）是組織纖維化的調(diào)控者，能夠有效刺激成纖維細胞和間葉母細胞的遷移和增殖分化，促進Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的合成?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組降解膠原蛋白的鋅依賴性內(nèi)肽酶，負責穩(wěn)態(tài)組織的修復和膠原蛋白的降解，Mmp-1和Mmp-8分別對Ⅲ型和Ⅰ型膠原蛋白具有較高的水解活性[42-43]。

圖3 小鼠皮膚膠原合成分解相關基因mRNA表達水平Fig.3 mRNA expression level of genes related to collagen synthesis and decomposition in mice skin

由圖3可知，小鼠連續(xù)注射D-半乳糖12周，顯著降低了膠原合成基因Tgf-β1的mRNA表達水平，提高了分解基因Mmp-1及Mmp-8mRNA表達水平（P＜0.05），進而使皮膚膠原蛋白分解增強，導致膠原蛋白含量減少。與之相反，衰老小鼠飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可顯著恢復皮膚膠原蛋白合成及分解相關基因mRNA表達水平，即顯著上調(diào)基因Tgf-β1，抑制基因Mmp-1及Mmp-8的表達（P＜0.05）。

2.3.3 荔枝玫瑰酒對小鼠皮膚抗氧化相關基因表達水平的影響

Nrf2/Gsk-3β信號通路是細胞內(nèi)重要的抗氧化通路，對機體調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的酶具有重要的調(diào)節(jié)作用[44]。ROS等應激物通過促進Keap1上半胱氨酸殘基的氧化，誘導Nrf2的釋放和活化，啟動多種下游靶蛋白的表達，如血紅素加氧酶1（Heme oxygenase-1，Ho-1），還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphatequinone oxidoreductase1，Nqo1）等[45]。Gsk-3β是一種糖原合成激酶，通過細胞核中Fyn的磷酸化，促進Nrf2的磷酸化，使其被降解，進而抑制抗氧化信號通路[46]。由圖4可知，與正常組相比，長期注射D-半乳糖氧化損傷小鼠皮膚，引起Nrf2、Ho-1及Nqo-1基因mRNA表達水平顯著下調(diào)，Gsk-3β基因表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。而衰老小鼠飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可顯著上調(diào)皮膚Ho-1及Nqo-1基因表達水平（P＜0.05），但對Nrf2、Gsk-3β基因表達無顯著性作用（P＞0.05）。

圖4 小鼠皮膚抗氧化相關基因mRNA表達水平Fig.4 mRNA expression level of genes related to antioxidant in mice skin

謝璟[41]報道楊梅黃酮能降低光老化小鼠皮膚中Mmp-1基因的表達，增強抗氧化酶活性來修復皮膚損傷；高愛莉等[47]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可激活Nrf2信號通路，增加抗氧化酶表達，對無毛鼠皮膚具有光防護的重要作用，與本研究結果一致。由此可見，荔枝玫瑰酒可能通過調(diào)節(jié)小鼠皮膚抗氧化相關基因表達，增強了抗氧化酶活性和抗氧化能力，平衡了皮膚氧化還原穩(wěn)態(tài)，進而緩解了衰老小鼠膠原分解，增強膠原蛋白合成能力，這可能與其含有豐富的多酚、黃酮等活性成分有關。

3 結論

本研究通過檢測荔枝玫瑰酒中的營養(yǎng)活性成分，發(fā)現(xiàn)該酒保留了豐富的多酚、黃酮、單寧及維生素C等活性成分，分別達到0.43 g/L、0.25 g/L、0.12 g/L和3.15 mg/100 mL。為進一步探究其是否具有抗皮膚衰老的功效，進行了動物實驗。結果表明，小鼠飼喂12周后，各組體質量增加但均無顯著性差異（P＞0.05），飼喂高劑量荔枝玫瑰酒可顯著提高D-半乳糖誘導的衰老小鼠皮膚含水率、羥脯胺酸和膠原蛋白含量，降低MDA含量、GSH-Px酶活性，提高GSH含量、SOD和CAT酶活性（P＜0.05）；同時通過提高衰老小鼠皮膚抗氧化基因Ho-1及Nqo-1mRNA表達水平，恢復皮膚膠原蛋白合成基因Tgf-β1及分解基因Mmp-1及Mmp-8表達水平，抑制小鼠皮膚氧化損傷和膠原分解，相關結果可為荔枝玫瑰酒的深入開發(fā)和推廣提供有價值的理論參考。