卜智斌，徐玉娟，溫 靖*，余元善，劉昊澄，鄒 波，周珊珊

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610；2.廣東佳寶集團有限公司，廣東 潮州 515638）

駿棗（Ziziphus jujubaMill.）是我國紅棗主栽品種之一，廣泛種植于我國新疆、山西等地。研究表明，駿棗富含氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚、多糖等營養(yǎng)成分[1-3]，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，有大量文獻報道其具有抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功效[4-6]。

現(xiàn)階段紅棗的精深加工產(chǎn)品主要有紅棗汁、紅棗干、紅棗片、紅棗酒、紅棗醋等[7]，駿棗作為新疆產(chǎn)量最大的紅棗，以鮮食和棗干消費為主，大規(guī)模的精深加工利用較為缺乏，研究表明，駿棗干的糖含量為60%～80%，復水打漿后非常適合果酒果醋的釀造[8-9]，對豐富駿棗精深加工產(chǎn)品類型，實現(xiàn)綜合加工利用具有重要的意義。目前關(guān)于棗醋的加工研究已有報道，但主要集中在不同品種紅棗的醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化研究，如王大紅等[10]優(yōu)化了板栗紅棗果醋醋酸發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，并測定了果醋的相關(guān)品質(zhì)指標，化志秀等[11]對比研究了初始棗汁、棗酒醪、棗醋的主要營養(yǎng)成分的含量及抗氧化活性，但對探討棗醋發(fā)酵過程中品質(zhì)變化及發(fā)酵前后風味成分分析的研究鮮有報道。

本研究將以駿棗原酒為主要原料，利用前期實驗室已優(yōu)化的醋酸發(fā)酵階段工藝條件，重點研究駿棗果醋發(fā)酵過程中酒精度、pH值、可滴定酸、有機酸、總多酚、維生素C、抗氧化能力變化，并對比分析發(fā)酵前后揮發(fā)性風味成分差異，以期為駿棗果醋的深加工及其產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駿棗果酒（酒精度12%vol）：實驗室制備；醋酸桿菌（Acetobacter aceti）As1.41：實驗室保藏；Folin-Ciocalteu試劑：上海源葉生物科技有限公司；磷酸（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、乳酸、草酸、抗壞血酸、蘋果酸、檸檬酸、醋酸、琥珀酸（標準品）：美國Sigma-Aldrich公司；焦性沒食子酸、葡萄糖、酵母粉、碳酸鈣、無水乙醇等其他試劑（均為分析純）：國藥集團化學試劑公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）測定檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

ALC-210.4分析天平：賽多利斯科學儀器有限公司；UV1800型紫外可見分光光度計、LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；PB-10型pH計：德國Sartorius公司；Infinite M200 Pro酶標儀：瑞士TECAN公司、JW-1042低速離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器、SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；6980N/5975B氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國Agilent 公司；手動固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）進樣器及萃取纖維頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

駿棗果酒酒精度調(diào)整→醋酸菌活化→醋酸發(fā)酵→駿棗果醋

操作要點：

（1）酒精度調(diào)整：在駿棗果酒中添加無菌水將酒精度調(diào)整至6%vol，待醋酸發(fā)酵備用。

（2）醋酸菌活化：取適量保藏的醋酸菌種加入已滅菌的醋酸菌液體培養(yǎng)基中（葡萄糖1%，酵母提取粉1%，CaCO31%，無水乙醇3%），30 ℃搖床中140 r/min活化培養(yǎng)48 h。

（3）接種發(fā)酵：按照10%（V/V）的比例，將活化后的醋酸菌菌液接種至酒精度調(diào)整后的駿棗果酒中，通過搖床培養(yǎng)發(fā)酵，保持通風，搖床溫度控制在28～30 ℃、140 r/min發(fā)酵3～4 d。

（4）取樣：發(fā)酵過程中每隔12 h取樣，取樣前充分攪拌均勻，分裝，冷凍儲藏備用。

1.3.2 分析檢測

酒精度測定：采用酒精計測定；可滴定酸含量測定：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酚含量測定：采用Folin-Ciocalteu法[12]；總抗氧化能力（T-AOC）測定：按照總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒進行；DPPH自由基清除能力測定：按照文獻[13]進行；抗壞血酸及有機酸含量測定：按照文獻[14]采用HPLC法測定；揮發(fā)性成分測定：按照文獻[15]采用SPME-GC-MS法。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析、SPSS 17.0軟件進行方差分析，使用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 駿棗果醋發(fā)酵過程中酒精度的變化

由圖1可知，醋酸發(fā)酵0～36 h期間，酒精度由6%vol下降至5%vol，應該是由于發(fā)酵液中初始酒精度對醋酸菌的生長有一定抑制作用，醋酸菌的增殖速度較為緩慢，使得酒精的降解量較小；在發(fā)酵36～72 h期間，酒精度則迅速從5%vol下降至1.5%vol，說明在此階段醋酸菌進入快速繁殖期，酒精的降解速度快速增加，因此可以認為這一階段應為發(fā)酵產(chǎn)酸的主要時期；在最后72～96 h期間，隨著酒精不斷耗盡，醋酸發(fā)酵接近結(jié)束。

圖1 駿棗果醋發(fā)酵過程中酒精度的變化Fig.1 Changes in alcohol content of jujube vinegar during the fermentation process

2.2 駿棗果醋發(fā)酵過程中pH值、可滴定酸的變化

由圖2可知，由于發(fā)酵過程中醋酸、乳酸等多種有機酸的生成，使得pH值不斷降低、可滴定酸含量不斷升高，兩者變化趨勢呈負相關(guān)趨勢。在發(fā)酵0～72 h期間，pH值不斷降低；發(fā)酵72～96 h期間下降速度趨于平緩?？傻味ㄋ岷坎粩嗌?，在發(fā)酵0～36 h期間，可滴定酸緩慢升高，由2.68 g/L升高至7.80 g/L；在發(fā)酵36～72 h期間，可滴定酸快速升高，含量由7.80 g/L升高至23.10 g/L；變化趨勢與圖1中酒精度的變化情況基本接近，說明駿棗果醋在發(fā)酵期間主要發(fā)酵階段為第36～72 h。

圖2 駿棗果醋發(fā)酵過程中pH值和可滴定酸的變化Fig.2 Changes in pH and titratable acid contents of jujube vinegar during the fermentation process

2.3 駿棗果醋發(fā)酵過程有機酸含量和酸味強度的變化

從表1可以看出，駿棗果酒中乳酸含量最高，達到2 335.47 mg/L，其次是醋酸和檸檬酸，是由于在酒精發(fā)酵中，通常伴隨著蘋果酸-酒精發(fā)酵[16]，乳酸菌能將蘋果酸轉(zhuǎn)化成乳酸和CO2，使得果酒發(fā)酵過程中乳酸大量累積，而醋酸則是釀酒酵母在厭氧條件下發(fā)酵過程中產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物之一[17]。

駿棗果醋中主要有機酸有醋酸、乳酸和檸檬酸，且醋酸、草酸、乳酸和琥珀酸在發(fā)酵前后有顯著性變化（P＜0.05），其中果醋中醋酸含量最高，發(fā)酵過程中含量顯著性升高，由1 951.25 mg/L升高至29 260.29 mg/L，升高接近15倍；乳酸含量僅次于醋酸，在發(fā)酵過程中呈先下降后升高的趨勢，在發(fā)酵36 h時含量達到最低；琥珀酸含量在0～36 h期間顯著性增加，隨后發(fā)酵36～96 h期間含量趨于穩(wěn)定且變化不顯著（P＞0.05），且琥珀酸是酵母菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物，由于駿棗果酒原料未經(jīng)熱殺菌處理，因此在醋酸發(fā)酵前期可能還存在酵母菌發(fā)酵，使得發(fā)酵前期琥珀酸含量顯著上升，后期隨著醋酸含量不斷增加，pH值不斷降低，抑制了酵母菌的生長，使得琥珀酸含量在發(fā)酵中后期趨于穩(wěn)定[18]。另外，檸檬酸與蘋果酸在發(fā)酵過程中含量均有減少，但變化不顯著（P＞0.05），可能由于蘋果酸在醋酸發(fā)酵過程中被醋酸菌少量利用或被降解；6種有機酸中草酸含量最低，在發(fā)酵前期較為穩(wěn)定，中后期含量顯著性降低，可能是因為被醋酸菌代謝利用或者在發(fā)酵的強氧化條件下被氧化降解引起[19]。

表1 駿棗果醋發(fā)酵過程中各種有機酸含量的變化Table 1 Changes in organic acid content of jujube vinegar during the fermentation process

參考各有機酸的味覺閾值[20]，測算出駿棗果醋發(fā)酵過程中各種有機酸的酸味強度，結(jié)果如表2所示。由表2可知，發(fā)酵過程中醋酸和琥珀酸的酸味強度逐漸增強，駿棗果酒中總酸味強度較低為439.73，其中醋酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸四種有機酸分別對總酸味強度的貢獻為36.90%、29.50%、22.01%、9.02%，合計為97.75%，該四種酸為駿棗果酒的主體酸味來源；經(jīng)過醋酸發(fā)酵后駿棗果醋的總酸味強度是駿棗果酒的6.17倍，而發(fā)酵后果醋中總有機酸僅為果酒的4.6倍，駿棗果醋中各種有機酸酸味強度大小依次為醋酸＞乳酸＞檸檬酸＞琥珀酸＞蘋果酸＞草酸，其中醋酸對總酸味強度的貢獻為89.93%，其他種類有機酸僅為10.07%，表明通過醋酸發(fā)酵后，醋酸是果醋酸味表現(xiàn)的主體酸，其他有機酸則為駿棗果醋的輔助酸味特征成分，是駿棗果醋具有一定果酸味的基礎。

表2 駿棗果醋發(fā)酵過程中酸味強度的變化Table 2 Changes in acidity intensity of jujube vinegar during the fermentation process

2.4 駿棗果醋發(fā)酵過程中維生素C和總酚含量的變化

由圖3可以看出，發(fā)酵過程中總酚含量不斷下降，由1.14 mg/mL下降至0.59 mg/mL，其在發(fā)酵0～48 h期間下降速度較快，發(fā)酵48～96 h期間下降速度趨于平穩(wěn)，總體下降近48%，與朱偉林等[21]在對比研究龍眼醋發(fā)酵過程中總酚含量變化趨勢一致，李騰宇[22]研究發(fā)現(xiàn)紅糖醋發(fā)酵過程中總多酚含量是逐漸減少的。維生素C含量在發(fā)酵0～36 h期間由17.87 mg/mL快速下降至14.41 mg/mL，下降近20%，后期則總體趨于穩(wěn)定。化志秀等[11，23]發(fā)現(xiàn)在液態(tài)深層發(fā)酵法發(fā)酵棗醋階段維生素C含量呈下降趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于醋酸發(fā)酵為好氧發(fā)酵，屬于氧化過程，長時間的氧化反應導致維生素C和酚類物質(zhì)發(fā)生降解[24]，從而使維生素C和總酚含量漸漸降低。

圖3 駿棗果醋發(fā)酵過程中維生素C和總酚含量的變化Fig.3 Changes in vitamin C contents and total phenols contents of jujube vinegar during the fermentation process

2.5 駿棗果醋發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

由圖4可知，DPPH自由基清除能力在發(fā)酵0～36 h期間下降，之后顯著升高，在發(fā)酵96 h后駿棗果醋的DPPH自由基清除率達到89.75%，相比發(fā)酵前駿棗果酒的DPPH自由基清除率升高7.22%，總抗氧化能力在發(fā)酵過程中同樣顯著性升高，在發(fā)酵96 h后駿棗果醋的總抗氧化能力達到0.74 mmol/L，相比發(fā)酵前駿棗果酒的總抗氧化能力提高2.9倍，與抗氧化成分總多酚和維生素C的變化趨勢相反，說明果醋發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率與抗氧化成分的含量變化不成正相關(guān)。同樣的，楊玉霞[25]的研究也發(fā)現(xiàn)百香果醋的DPPH自由基清除能力顯著優(yōu)于百香果酒，高出將近32%，化志秀等[11]的研究同樣發(fā)現(xiàn)紅棗醋發(fā)酵階段維生素C含量下降、總抗氧化力呈極顯著上升趨勢，CHEN Y等[26]研究柑橘醋發(fā)酵過程中總黃酮含量下降6.4%、總多酚含量升高5.7%，但抗氧化活性升高46.7%，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于醋酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生了某些代謝產(chǎn)物，有利于清除DPPH自由基，也有可能是由于果醋發(fā)酵過程中醋酸含量大幅上升，酸度的不斷升高提供了更多帶正電的氫離子，進而提高了自由基的清除率[27]。

圖4 駿棗果醋發(fā)酵過程抗氧化能力的變化Fig.4 Changes in total antioxidant capacities of jujube vinegar during the fermentation process

2.6 駿棗果醋發(fā)酵前后風味成分的變化

表3 駿棗果酒和果醋中香氣物質(zhì)種類及相對含量Table 3 Aroma components and relative contents of jujube wine and jujube vinegar

續(xù)表

由表3可知，從駿棗果酒和果醋中共檢測到65種香氣物質(zhì)，其中駿棗果酒中有47種，主要分為酯類（23種）、烴類（7種）、醛類（9種）、醇類（3種）、酮類（2種）、醚類（1種）、酚類（1種）和其他物質(zhì)（1種）等8大類揮發(fā)性化合物。駿棗果醋中檢測到39種香氣物質(zhì)，主要分為酯類（18種）、酸類（3種）、烴類（3種）、醛類（4種）、醇類（7種）、酮類（1種）、酚類（1種）和其他物質(zhì)（2種）等8大類揮發(fā)性化合物。對比發(fā)酵前后，紅棗酒和紅棗醋共有香氣物質(zhì)21種，紅棗醋中烴類化合物減少了4種、酯類和醛類化合物分別減少了5種，增加了乙酸、庚酸、癸酸3種酸類化合物和4種醇類化合物。應該是由于發(fā)酵過程中酯類物質(zhì)發(fā)生分解，醛類、酮類等物質(zhì)進一步還原成酸，使得發(fā)酵后酯類化合物種類減少、酸類化合物種類增加。

駿棗果酒中酯類揮發(fā)性化合物相對含量最高為44.75%，其中甲酸異戊酯相對含量最高為20.71%、乙酸乙酯相對含量為7.97%、丁二酸二乙酯相對含量為4.20%，駿棗果醋中酯類揮發(fā)性化合物相對含量最高為37.27%，其中乙酸乙酯相對含量最高為22.62%、乙酸異戊酯相對含量為9.17%，對比發(fā)酵前后，酯類化合物中乙酸乙酯升高14.76%、乙酸異戊酯升高7.25%、甲酸異戊酯降低20.37%，果醋的發(fā)酵風味物質(zhì)是主要由乙酸乙酯或甲酸乙酯引起，發(fā)酵風味強多是由于這些物質(zhì)的含量過高。

發(fā)酵后駿棗果醋中新增酸類揮發(fā)性化合物，相對含量為30.72%，僅次于酯類化合物，其中乙酸相對含量最高為30.55%，另外兩種揮發(fā)酸相對含量較低，庚酸為0.08%、癸酸為0.09%，構(gòu)成了果醋主要的揮發(fā)性風味成分，具有顯著的呈味作用，可修飾其他滋味，起到一定的改善調(diào)和風味的效果。另外，紅棗醋中醛類物質(zhì)相對含量僅為1.26%，相比紅棗酒（9.27%）大幅下降，由于部分醛類物質(zhì)具有類似苦杏仁、辛辣刺激的不良風味[28]，因此通過醋酸發(fā)酵能夠有助于提高駿棗果醋的整體風味效果。

3 結(jié)論

通過分析駿棗果醋發(fā)酵過程中酒精度、pH值、可滴定酸、有機酸、維生素C、總酚含量及抗氧化活性等品質(zhì)指標變化情況，及發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的差異，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵36～72 h期間，酒精度快速從5%vol下降至1.5%vol，可滴定酸快速積累，由7.8 g/L升高至23.1 g/L，該階段為發(fā)酵產(chǎn)酸的主要時期；檢測到發(fā)酵過程中主要有醋酸、草酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸共6種有機酸，其中醋酸含量最高，其次是乳酸，醋酸和琥珀酸在發(fā)酵過程中含量顯著性升高，乳酸和草酸含量顯著性降低，檸檬酸和蘋果酸含量整體變化較為穩(wěn)定。發(fā)酵過程中總酚含量不斷下降，維生素C含量則在0～36 h期間下降近20%后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵過程中總抗氧化能力一直呈顯著性升高趨勢，DPPH自由基清除能力先稍微下降后顯著性升高。GC-MS分析結(jié)果表明，發(fā)酵后駿棗果醋中檢測到香氣物質(zhì)共39種，相比發(fā)酵前駿棗果酒減少醚類揮發(fā)性化合物，但增加了3種酸類揮發(fā)性化合物。后續(xù)將重點研究駿棗果醋的澄清及乳酸分離工藝，并評價駿棗果醋貯存期品質(zhì)及風味的變化，以期為開發(fā)優(yōu)質(zhì)駿棗果醋新產(chǎn)品，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供更為充分的參考依據(jù)。