劉欣 劉艷芬 訾建杰 舒郁 孔令喆 鄭倩 閆慧 韓寶艷

骨髓增生異常綜合征(MDS)是造血干/祖細胞分化發(fā)育異常導致骨髓造血功能衰竭、外周全血細胞減少的一組異質性克隆性疾病[1,2]。MDS發(fā)病機制復雜，其中骨髓微環(huán)境炎性因子、低氧誘導因子1α(HIF-1α)及其下游靶基因血管內皮生長因子(VEGF)表達異常在MDS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用，參與調控細胞增殖、凋亡及多藥耐藥性[3,4]。本研究探討了HAG(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+粒細胞集落刺激因子)聯(lián)合地西他濱對MDS患者炎性因子、HIF-1α、VEGF表達的影響，以期為此類疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2014年2月至2015年1月我院收治的MDS患者86例，隨機分為HAG組和聯(lián)合組，每組43例。HAG組男24例，女19例；年齡26～71歲，平均(54.3±6.5)歲；分型：難治性貧血伴原始細胞增多-2 27例，難治性貧血伴原始細胞增多-1 11例，MDS轉化急性髓系白血病(AML)4例，慢性-單核細胞白血病1例；IPSS分組：中危-1 15例，中危-2 22例，高危6例。聯(lián)合組男25例，女18例；年齡25～72歲，平均(53.4±6.0)歲；分型：難治性貧血伴原始細胞增多-2 26例，難治性貧血伴原始細胞增多-1 12例，MDS轉化AML3例，慢性-單核細胞白血病2例；IPSS分組：中危-1 13例，中危-2 25，高危5例。2組性別比、年齡、分型、IPSS分級比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2 納入及排除標準 納入標準：(1)符合MDS相關診斷標準[5]；(2)所有患者具有全血細胞減少、造血功能衰竭等典型表現(xiàn)；(3)患者及家屬簽署知情同意書。 排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)肝腎等重要臟器功能障礙者；(3)精神疾病患者；(4)入組前6個月服用過影響造血功能的藥物者；(5)對治療藥物過敏者；(6)妊娠期或哺乳期女性患者。

1.3 治療方法 2組均給予抗感染、營養(yǎng)支持治療。HCG組給予高三尖杉酯堿(辰欣藥業(yè)股份有限公司，1 ml∶1 mg)+阿糖胞苷(海正輝瑞制藥有限公司)+粒細胞集落刺激因子(協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社)治療。高三尖杉酯堿，1 mg/d，1次/d，溶于250 ml 5%葡萄糖注射液中，靜脈滴注；阿糖胞苷，2 mg/kg，1次/d，靜脈滴注；粒細胞集落刺激因子，300 μg/d，1次/d，靜脈滴注。連用14 d。聯(lián)合組在HAG組治療基礎上加用地西他濱(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司)，15 mg/m2，1次/8 h，靜脈滴注。連用3 d。

1.4 實驗方法

1.4.1 造血功能:采集患者空腹靜脈血，離心取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清GDF11、可溶性轉鐵蛋白(sTfR)含量。

1.4.2 炎性因子:采用ELISA測定血清白介素13(IL-13)、白介素10(IL-10)水平。

1.4.3 HIF-1α、VEGF:采用ELISA測定血清低氧誘導因子1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)水平。

1.4.4 Real time-PCR:采集骨髓液5 ml，置于肝素抗凝管中，等量PBS稀釋后加入淋巴細胞分離液，密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(BMMNC)。Trizol提取BMMNC總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，Real time-PCR法測定HIF-1α、VEGF mRNA表達量，設β-actin為內參照基因，目的基因表達相對值為2-ΔΔCt。

1.4.5 Western blot:提取BMMNC總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜，室溫下10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，TBST洗膜3次。ECL化學發(fā)光法顯色、定影。

1.4.6 預后:采用ELISA測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、β2微球蛋白(β2-MG)、鐵蛋白(SF)。記錄2組向AML轉化率。

2 結果

2.1 2組造血功能比較 2組治療前血清GDF11、sTfR差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后血清GDF11、sTfR均較治療前降低(P<0.05)，且聯(lián)合組GDF11、sTfR低于HAG組(P<0.05)。見表1。

表1 2組造血功能比較

2.2 2組血清炎性因子比較 2組治療前血清IL-13、IL-10比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后血清IL-13均較治療前顯著升高，IL-10均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組IL-13高于HAG組，IL-10低于HAG組(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清炎性因子比較

2.3 2組血清HIF-1α、VEGF比較 2組治療前血清HIF-1α、VEGF比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后血清HIF-1α、VEGF均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組HIF-1α、VEGF低于HAG組(P<0.05)。見表3。

2.4 2組BMMNC HIF-1α、VEGF表達比較 2組治療前BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達低于HAG組(P<0.05)。見表4。

表3 2組血清HIF-1α、VEGF比較

表4 2組BMMNC HIF-1α、VEGF表達比較

2.5 2組預后相關指標比較 2組治療前LDH、β2-MG、SF比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后LDH、β2-MG、SF均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組LDH、β2-MG、SF低于HAG組(P<0.05)。見表5。

表5 2組預后相關指標比較

2.6 2組向AML轉化率比較 HAG組、聯(lián)合組向AML轉化率分別為27.91%(12/43)、16.28%(7/43)，聯(lián)合組向AML轉化率低于HAG組(P<0.05)。見表6。

表6 2組向AML轉化率比較 n=43，例(%)

3 討論

MDS是一組以髓系細胞異常分化、病態(tài)造血為特征的造血干細胞疾病，80%的患者表現(xiàn)為不同程度的外周全血細胞減少，向急性髓系白血病轉化風險高，嚴重威脅患者生命安全[6,7]。我們前期研究證實，HAG聯(lián)合地西他濱治療MDS臨床緩解率高于單純HAG治療，且安全性高[8]。本研究進一步探討聯(lián)合用藥的治療機制，旨在為疾病治療提供理論依據(jù)。

GDF11是TGF-β超家族的重要成員，通過參與晚期紅細胞成熟、分化發(fā)育調控骨髓造血功能。研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者血清GDF11水平升高，且與預后密切相關[9]。sTfR是反映機體鐵儲存量、骨髓幼紅細胞比例及紅系造血功能的主要指標[10]。本研究結果顯示，2組治療前血清GDF11、sTfR比較無差異差異(P>0.05)；2組治療后血清GDF11、sTfR均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組低于HAG組(P<0.05)，提示聯(lián)合組能夠有效改善MDS患者造血功能，延緩疾病進展，療效優(yōu)于單純HAG治療。

目前，MDS發(fā)病機制尚未闡明，研究發(fā)現(xiàn)骨髓造血微環(huán)境異常在疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6-10]。IL-13是活化T細胞分泌的細胞因子，具有誘導B細胞增殖分化并抑制炎性反應等作用。IL-10是參與調控機體免疫炎性反應的重要細胞因子，并可作用于Th1細胞抑制IFN-γ的分泌和釋放[11]。本研究結果顯示，2組治療前血清IL-13、IL-10比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后血清IL-13均較治療前顯著升高，IL-10均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組IL-13高于HAG組，IL-10低于HAG組(P<0.05)，提示聯(lián)合組能夠通過調控炎性因子分泌糾正免疫紊亂，從而改善骨髓造血功能。

HIF-1α是缺氧狀態(tài)下被激活的轉錄激活因子，腫瘤細胞由于增殖代謝旺盛，導致HIF-1α降解受阻及水平增高[12]。研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者血清HIF-1α水平增高，通過調控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、耐藥性參與腫瘤致病過程[13]。另外，HIF-1α能夠調控VEGF等下游靶基因的表達調控血管新生，從而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[14]。研究顯示，本研究結果顯示，2組治療前血清HIF-1α、VEGF及BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2組治療后血清HIF-1α、VEGF及BMMNC HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表達均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組以上指標變化程度較HAG組明顯(P<0.05)，說明聯(lián)合組通過下調HIF-1α、VEGF表達抑制腫瘤血管新生。

LDH是機體損傷和代謝紊亂時分泌的一種糖酵解酶，在白血病、惡性腫瘤細胞表達上調[15]。β2-MG 是白細胞、淋巴細胞等分泌的一種球蛋白，其在健康人血清水平極低，當炎癥應激狀態(tài)或惡性腫瘤細胞表達增高，參與調控細胞增殖[16]。SF是一種可溶性鐵蛋白，在MDS等血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者血清水平增高，可作為判斷疾病治療效果及預后的敏感指標[17]。本研究結果表明，2組治療前LDH、β2-MG、SF比較無差異(P>0.05)；2組治療后LDH、β2-MG、SF均較治療前顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合組低于HAG組(P<0.05)；此外，HAG組、聯(lián)合組向AML轉化率分別為27.91%(12/43)、16.28%(7/43)，聯(lián)合組向AML轉化率低于HAG組(P<0.05)。說明聯(lián)合組能夠顯著降低MDS向AML轉化率，改善患者預后，機制與調控炎性因子、HIF-1α、VEGF表達有關。

綜上所述，HAG聯(lián)合地西他濱能夠改善MDS患者造血功能及預后，機制與調控炎性因子、HIF-1α、VEGF表達有關。