李立新 潘婧 齊菊菊 梁蕓 李玉雪 宋國威 萬玲玲

老年人下呼吸道感染通常由細(xì)菌、支原體、衣原體及病毒等微生物引起，臨床癥狀不具有典型性[1,2]。傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測方法，如細(xì)菌培養(yǎng)等方法雖特異性較高，但由于其受影響的因素較多，易存在陽性率低、耗時長等缺點(diǎn)，不利于疾病的早期診斷，易造成抗生素濫用等問題。因此，尋找快速準(zhǔn)確的檢測方案，已成為細(xì)菌性肺炎診斷的研究熱點(diǎn)。檢測肺部感染的方法有多種，包括臨床特征、放射學(xué)檢查、炎性標(biāo)志物、血液培養(yǎng)、細(xì)胞學(xué)和微生物學(xué)等[3]。血清生物標(biāo)志物如白細(xì)胞計(jì)數(shù)、乳酸脫氫酶、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和葡萄糖也被證明是有效的檢測方法[4]。近年來，PCT被認(rèn)為是是診斷和監(jiān)測細(xì)菌炎性感染的一個重要標(biāo)志物，反映全身炎性反應(yīng)的活躍程度。CRP在急性炎性和感染時，其與疾病活動性有良好的相關(guān)。血清淀粉樣道白A(SAA)也是一種急性時相反應(yīng)蛋白，其在急性細(xì)菌感染早期上升幅度大、靈敏度高，較CRP優(yōu)勢明顯[5]。細(xì)胞因子參與了急慢性疾病的病理、生理過程[6]，其中TNF-α、IL-10、IL-6及IL-2是機(jī)體內(nèi)重要的炎性因子，參與機(jī)體內(nèi)的免疫過程，當(dāng)機(jī)體受到傷害或者感染時，炎性反應(yīng)激活先天性免疫及免疫應(yīng)答，引起細(xì)胞因子的升高[6]。通過對老年細(xì)菌性下呼吸道感染患者細(xì)胞因子、PCT、CRP、SAA及WBC等指標(biāo)的檢測，可以來評估機(jī)體所處的免疫功能狀態(tài)及感染程度，為患者疾病的輔助診斷、用藥及預(yù)后干預(yù)提供重要的參考依據(jù)。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年9月至2020年1月因下呼吸道感染住院的老年患者75例為研究對象，包括男43例，女32例；年齡60～97歲；其中細(xì)菌培養(yǎng)陽性患者55例作為細(xì)菌感染組，病毒檢測陽性患者20例作為病毒感染組，隨機(jī)選取同期我院健康體檢者30例作為對照組，其中男15例，女15例；年齡60～89歲。3組性別比、年齡等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)IDSA/ATS指南(2007版)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷下呼吸道細(xì)菌性感染者；有咳嗽咳白色黏稠狀痰液或黃痰等癥狀，并有發(fā)熱現(xiàn)象,肺部出現(xiàn)濕羅音者；X線或者CT顯示肺部有炎性浸潤性病變者；有≥3次痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)陽性者入組細(xì)菌感染組；咽拭子或痰液病毒核酸檢測陽性同時細(xì)菌培養(yǎng)陰性者入組病毒感染組。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重臟器衰竭者；合并結(jié)核栓塞水腫等肺部疾病者；合并肺癌等腫瘤患者；合并精神疾病者?；颊?、家屬均知情且自愿簽署研究同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞因子檢測：所有受試者清晨采集3 ml肘靜脈血于含有乙二胺四乙酸二(EDTA-k2)抗凝管中，4 h 內(nèi)將血液3 000 r/min離心20 min，分離上層血漿，置于-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫捎昧魇矫庖邿晒饧夹g(shù)測定血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ及IL-17水平，所用儀器為Beckman Coulter Navios流式細(xì)胞分析儀，試劑盒是賽基生物的人Th1/Th2/Th17亞群檢測試劑盒(流式熒光法)，所用操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 PCT、CRP及SAA檢測：所有受試者清晨采集3 ml肘靜脈血于采血管內(nèi)，根據(jù)不同檢測項(xiàng)目進(jìn)行相應(yīng)的處理，得到全血、血清或血漿。所用儀器分別為星童醫(yī)療技術(shù)有限公司的循環(huán)增強(qiáng)熒光分析儀、Beckman Coulter AU5800和深圳普門科技股份有限公司的特定蛋白分析儀，試劑為降鈣素原檢測試劑盒(循環(huán)增強(qiáng)熒光免疫法)、全程C-反應(yīng)蛋白測定試劑盒(膠乳免疫比濁法)和血清淀粉樣蛋白A(SAA)測定試劑盒(散射比濁法)，所用操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。參考值：PCT<0.5 ng/ml、SAA<10.0 mg/L、CRP<10.0 mg/L、WBC(3.5～9.5)×109/L，以PCT≥0.5 ng/ml、SAA≥10.0 mg/L、CRP≥10.0 mg/L、WBC>9.5×109/L為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.3 呼吸道病原體多重PCR檢測：采用全自動核酸提取儀對每份受試者咽拭子標(biāo)本進(jìn)行自動核酸提取。通過多重 RT-PCR 技術(shù)，在Applied Biosystems 3500Dx基因分析儀上進(jìn)行檢測，試劑為寧波海爾施提供的13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒，所有操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 3組血清7種細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 3組血漿IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IL-17水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IFN-γ水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌感染組血漿中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IL-17水平高于對照組(P<0.05)，IL-2、IL-4、IL-6及L-10水平高于病毒感染組 (P<0.05)；病毒感染組IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IL-17水平均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組血清中7種細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

2.2 3組PCT、CRP、SAA及WBC表達(dá)水平比較 3組PCT、CRP、SAA及WBC水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌感染組PCT、CRP、SAA及WBC水平高于病毒組及對照組(P<0.05)；病毒感染組CRP、SAA及WBC水平均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組PCT、CRP、SAA及WBC表達(dá)水平比較

2.3 七種細(xì)胞因子診斷細(xì)菌感染的診斷效果 ROC曲線分析結(jié)果顯示，IL-2、IL-4、IL-6及IL-10在鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染與病毒性下呼吸道感染上，ROC 曲線下面積分別0.759、0.766、0.931、0.781。IL-6的診斷效能最高，當(dāng)取臨界值時，IL-6的特異性分別為93.9%，敏感度分96.2%。見表3，圖1。

表3 IL-2、IL-4、IL-6及IL-10細(xì)胞因子鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染的ROC曲線分析

2.4 PCT、CRP、SAA及WBC對診斷細(xì)菌感染的診斷效果 ROC曲線分析結(jié)果顯示，PCT、CRP、SAA及WBC在鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染與病毒性下呼吸道感染上，ROC 曲線下面積分別。SAA的診斷效能最高，當(dāng)取臨界值時，SAA的特異性分別為87.9%，敏感度分92.3%。見表4，圖2。

表4 PCT、CRP、SAA及WBC鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染的ROC曲線分析

2.5 細(xì)胞因子IL-6、SAA與IL-6+SAA聯(lián)合對診斷細(xì)菌感染的診斷效果 ROC曲線分析結(jié)果顯示，IL-6、SAA與IL-6+SAA聯(lián)合在鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染與病毒性下呼吸道感染上，ROC 曲線下面積分別0.931、0.941、0.994。IL-6+SAA聯(lián)合的診斷效能最高，當(dāng)取臨界值時，IL-6+SAA聯(lián)合的特異性分別為93.9%，敏感度分96.2%。見表5，圖3。

表5 IL-6、SAA與IL-6+SAA聯(lián)合鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染的ROC曲線分析

3 討論

與青壯年人群相比，老年人群(≥65歲)呼吸系統(tǒng)疾病有著更高的發(fā)病率和死亡率，其發(fā)病率是青壯年人群的4倍[2]。老年人由于免疫功能下降可能會存在各種基礎(chǔ)疾病，由于目前我國老齡化問題嚴(yán)重，因下呼吸道感染而住院治療的老年患者也逐年增加，將給醫(yī)療、社會等帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8]。由于目前病原學(xué)鑒定方法如細(xì)菌培養(yǎng)等耗時長、靈敏度低等缺點(diǎn)，難以及時確定致病菌并選擇合理有效的治療方案，易導(dǎo)致患者延誤病情，甚至造成抗菌藥物的濫用。據(jù)報道，抗菌藥物治療不足會影響感染患者的發(fā)病率和死亡率[9,10]。因此，對細(xì)菌性下呼吸道感染患者做出及時的診斷并對病情進(jìn)行合理評估是正確使用抗生素的關(guān)鍵[11]，所以需要一種敏感而特異的標(biāo)記物來早期識別細(xì)菌感染。

本研究針對老年細(xì)菌性下呼吸道感染進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果提示血清中IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-17的表達(dá)水平可以反映老年患者下呼吸道感染情況。在本研究中細(xì)菌感染組患者血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10的表達(dá)水平顯著高于病毒感染組，說明細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎性可引起更高的細(xì)胞因子反應(yīng)，而細(xì)胞因子增高的程度可反應(yīng)感染的嚴(yán)重程度。本研究還發(fā)現(xiàn)IL-6在鑒別診斷細(xì)菌性下呼吸道感染與病毒性下呼吸道感染有著很大的潛力，其靈敏度和特異性分別為96.2%和93.9%。本研究與郝燕燕等[12-14]的研究結(jié)果研究結(jié)果相似。不同的是，本研究結(jié)果還顯示了病毒感染患者細(xì)胞因子IL-17的升高。免疫系統(tǒng)是抵抗病原體的第一道防線。細(xì)胞因子和趨化因子是免疫細(xì)胞活化所產(chǎn)生的第一個衍生物。IL-6作為重要的促炎細(xì)胞因子之一，在炎性性疾病患者中升高[15]。IL-10是一種主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，它能抑制抗原呈遞細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能，抑制Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生，是公認(rèn)的炎性和免疫抑制因子。IL-6在一定程度上被認(rèn)為是IL-10產(chǎn)生的誘導(dǎo)劑。IL-17可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎性因子及趨化因子的表達(dá)引起炎性細(xì)胞的浸潤和組織破壞，起著重要的抗感染作用[16,17]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為當(dāng)IL-6和IL-10顯著上升數(shù)百倍甚至數(shù)千倍時，往往病情會迅速發(fā)展，需密切觀察，并可提醒臨床采取相應(yīng)措施[15,18-20]。對老年下呼吸道感染患者的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測有助于判斷機(jī)體所處的免疫功能狀態(tài)，可為疾病發(fā)展的監(jiān)測提供參考依據(jù)，也對疾病的輔助診斷、用藥及預(yù)后干預(yù)有重要的臨床指導(dǎo)意義。

在本研究中，我們還研究了3組的CRP、SAA、PCT和白細(xì)胞等指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示細(xì)菌感染組PCT、CRP、SAA及WBC水平高于病毒組及對照組；病毒感染組CRP、SAA及WBC水平均高于對照組。本研究與林國輝等[21]的研究結(jié)果相似，均顯示細(xì)菌感染組血清SAA、CRP、PCT指標(biāo)水平明顯高于病毒感染組，對臨床醫(yī)師就患者肺部感染情況進(jìn)行初步判斷及指導(dǎo)抗生素的使用有一定的意義。本研究就對鑒別診斷細(xì)菌性與病毒性下呼吸道感染進(jìn)行ROC分析顯示，SAA具有很高的檢測效能，其靈敏度和特異性分別為92.3%和87.9%，PCT診斷特異性最高可達(dá)90.9%，但其靈敏度較低，僅為57.7%。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PCT的濃度反映了全身炎性的嚴(yán)重程度，并可預(yù)測死亡率[22,23]。正常情況下，血清PCT濃度在病毒感染時可以忽略不計(jì)或相對較低，而在細(xì)菌感染后，其濃度顯著升高，可在肺部感染的鑒別中起作用[24]。血清淀粉樣蛋白A(SAA)在急性和慢性炎性中起重要作用，并在臨床實(shí)驗(yàn)室中用作炎性指標(biāo)。本研究將IL-6與SAA聯(lián)合用于鑒別診斷細(xì)菌性與病毒性下呼吸道感染，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用IL-6或SAA具有更高的鑒別價值，其靈敏度與特異性高96.2%與93.9%。生物標(biāo)志物的組合，與單獨(dú)使用任何一種炎性因子相比，它能提供更多的疾病信息和更高的靈敏度與特異性，并且對于指導(dǎo)抗生素治療具有更準(zhǔn)確的意義[25,26]。

雖然本研究提示IL-6與SAA聯(lián)合檢測可作為鑒別診斷診斷細(xì)菌性與病毒性下呼吸道感染的標(biāo)志物，但本研究存在一定的局限性。第一，增加抗生素治療可能降低SAA水平，檢測效果。此外，由于統(tǒng)計(jì)標(biāo)本量少，可能研究結(jié)果會有一定的偏差，本研究下一步將收集大批量標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，老年細(xì)菌性下呼吸道感染患者血清中IL-4、IL-6、IL-10、PCT、CRP、SAA及WBC的表達(dá)顯著高于病毒感染組。IL-6與SAA聯(lián)合檢測可以更好的鑒別診斷細(xì)菌與病毒性感染，對指導(dǎo)臨床醫(yī)師抗生素的合理有效使用有重要價值，并且對炎性指標(biāo)的動態(tài)監(jiān)測將有利于評估患者免疫水平及及預(yù)測疾病的轉(zhuǎn)歸。