王亞明 于麗霞 王靜 楊龍龍 王朝輝 宋曉明 張小輝 郭曉娟 方麗

胃癌即發(fā)生于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，與長期幽門螺旋桿菌感染、胃部疾病及飲食習(xí)慣等有密切聯(lián)系。早期胃癌患者癥狀較隱匿，僅出現(xiàn)輕微的胃腸道癥狀，因而常被患者忽視。在中國，胃癌為排名第二位的惡性腫瘤，年發(fā)病率為36.2/10萬，嚴(yán)重威脅我國公眾的生命健康[1]。早期預(yù)防、早期診斷和早期治療是改善胃癌患者生活質(zhì)量，提高生存率的關(guān)鍵措施，因此尋求一種敏感度高的預(yù)測(cè)胃癌患者臨床預(yù)后引起臨床研究者的廣泛關(guān)注[2]。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK-1)是蛋白激酶B、p70核小體S6激酶、p90核小體S6激酶、血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶以及蛋白激酶C等AGC激酶活化環(huán)的主要激酶，也是蛋白激酶B的上游信號(hào)分子，在人體心臟、肝臟、脾臟、大腦及胃等重要組織器官中廣泛表達(dá)，近年來倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，PDK-1在許多惡性腫瘤中異常活化，其主要是通過激活蛋白激酶B，進(jìn)而介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路來導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移[4]。PDK-1參與和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移，在食管癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)的現(xiàn)象。本研究選取2010年3月至2012年9月本院收治的96例行胃癌手術(shù)治療患者作為研究對(duì)象，擬通過對(duì)本院收治的胃癌患者的PDK-1蛋白表達(dá)情況進(jìn)行觀察分析，旨在探討胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)與臨床特征及預(yù)后狀況的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年3月至2012年9月本院收治的行胃癌手術(shù)治療患者作為研究對(duì)象，共納入96例患者，其中男54例，女42例;年齡31～84歲，平均年齡(59.3±10.1)歲；根據(jù)原發(fā)腫瘤最大直徑可分為：直徑>5 cm 62例，直徑≤5 cm 34例；根據(jù)腫瘤分化程度可分為：低分化48例，中分化34例，高分化14例；根據(jù)腫瘤原發(fā)部位可分為上部39例，中部40例，下部17例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第7版[6]胃癌TNM分期可分為：Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期56例；根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可分為：區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移83例，無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例。同時(shí)選取同期本院健康體檢者96例，其中男55例，女41例；年齡30～85歲，平均年齡(59.4±10.3)歲；均滿足本研究納入、排除標(biāo)準(zhǔn)。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并經(jīng)病理檢查證實(shí)診斷；②患者及家屬了解試驗(yàn)?zāi)康?，明確試驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，簽署知情同意書，并經(jīng)本院醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過；③患者年齡>18歲；④既往不存在精神疾病等干擾試驗(yàn)正常進(jìn)行的患者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②手術(shù)治療前有接受腫瘤相關(guān)治療；③手術(shù)治療前已經(jīng)出現(xiàn)胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；④手術(shù)治療后行放療、二次手術(shù)或生物免疫治療者；⑤試驗(yàn)過程中應(yīng)不能耐受中途退出者；⑥存在其他部位嚴(yán)重疾病的患者。

1.3 方法

1.3.1 資料收集:收集入選胃癌患者的臨床和隨訪資料，使用統(tǒng)一調(diào)查表摘錄相關(guān)內(nèi)容，資料內(nèi)容主要包括性別、年齡、胃癌病理類型、臨床分期、腫瘤部位和大小、治療方式、轉(zhuǎn)移情況、浸潤情況等。

1.3.2 石蠟切片:選取所選患者的術(shù)后癌組織和癌旁正常組織(取距腫瘤邊緣>5 cm處組織作為正常組織)，取得合適組織標(biāo)本修材后，甲醛固定，二甲苯透明，蠟塊包埋，冷卻后使用切片機(jī)以5 μm厚度每層連續(xù)切片，冷卻后備用。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)化試劑盒及二步法抗兔購于杭州赫貝科技有限公司，兔源抗人PDK-1單克隆抗體購于上海昕浩生物科技有限公司。主要儀器有光學(xué)顯微鏡等。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)方法：具體實(shí)驗(yàn)操作由專人嚴(yán)格按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行，按照無菌條件操作，所用器具均按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行高壓滅菌及烘干處理。首先取出保存在-80℃冰柜中的正常胃黏膜、胃癌組織，加入少量液氮，將其碾碎成粉末狀態(tài)。將組織粉末轉(zhuǎn)移至2 ml Eppendorf管中，加入1.2 ml PBS(pH值為7.4)，充分震蕩后離心20 min取上清液。獲取胃組織勻漿后，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)所選胃癌組織中PDK-1的表達(dá)。操作過程中采用己知陽性切片作為陽性對(duì)照，用PBS緩沖液為一抗行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 免疫組化：結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]采用半定量法，應(yīng)用普通光學(xué)顯微鏡，隨機(jī)選取5個(gè)不同高倍鏡下(400×)視野，0分表示為無陽性細(xì)胞，1分表示為陽性細(xì)胞數(shù)目百分率<10%，2分表示為陽性細(xì)胞數(shù)目百分率為10%～50%，3分表示為陽性細(xì)胞數(shù)目百分率為51%～80%，4分表示為陽性細(xì)胞數(shù)目百分率>80%。同時(shí)觀察染色強(qiáng)度，0分表示為無著色，1分表示為淡黃色，2分表示為棕黃色，3分表示為棕褐色。最后PDK-1的表達(dá)以染色強(qiáng)度積分與陽性細(xì)胞百分率積分的乘積進(jìn)行判定，其中所得分?jǐn)?shù)<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。病理閱片及染色積分判定由兩位病理專家盲法觀察完成。

1.4 隨訪方式 所選患者均經(jīng)電話隨訪或門診復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，隨訪周期為術(shù)后1年內(nèi)每3個(gè)月1次，3年內(nèi)每3～6個(gè)月1次，5年內(nèi)每6個(gè)月1次，之后每1年1次。隨訪至患者死亡或2017年9月1日為止，入選患者隨訪率為100%，生存時(shí)間以月為單位。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)情況 PDK-1蛋白表達(dá)于胃癌癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色表示為陽性，無特異性染色表示陰性。在所選胃癌患者癌細(xì)胞組織中，PDK-1蛋白陽性表達(dá)率為68.75%；正常組織中，PDK-1蛋白陽性表達(dá)率為9.38%，胃癌組織PDK-1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于正常組織的陽性表達(dá)率(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)情況 n=96

圖1 正常組織和癌細(xì)胞組織的表達(dá)情況(免疫組化×400)；A為正常組織，B為癌細(xì)胞組織

2.2 胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 所選胃癌患者隨訪存活1～72個(gè)月，中位生存期為37個(gè)月，術(shù)后5年生存者共34例，生存率為35.42%(34/96)。不同PDK-1蛋白的表達(dá)水平患者生存情況：(1)PDK-1蛋白低表達(dá)患者隨訪存活1～72個(gè)月，中位生存期為61個(gè)月，術(shù)后5年存活率分別為70.83%(68/96)；(2)PDK-1蛋白高表達(dá)患者隨訪存活1～64個(gè)月，中位生存期33個(gè)月；術(shù)后5年存活率分別為15.63%(15/96)。PDK-1蛋白高表達(dá)患者術(shù)后5年存活率明顯低于PDK-1蛋白低表達(dá)患者(χ2=140.108，P<0.01)。

2.3 胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)單因素分析顯示：年齡、分化類型、TNM分期、腫瘤直徑、浸潤程度與胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)有關(guān)(P<0.05)；性別、發(fā)病部位、手術(shù)方式、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)無關(guān)(P>0.05)。見表2。

2.4 胃癌患者預(yù)后多因素分析 經(jīng)多元Cox逐步回歸分析，除TNM分期晚期(Ⅲ期)、低分化類型、腫瘤直徑>5 cm、浸潤程度達(dá)漿膜及漿膜外之外，同時(shí)PDK-1蛋白高表達(dá)也是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

3 討論

胃癌是消化科常見的消化道惡性腫瘤疾病，好發(fā)于50歲以上的中老年人，男女發(fā)病率比為2∶1，其較高的發(fā)病率和病死率嚴(yán)重威脅人們的健康[8,9]。雖然目前臨床上存在放療、化療、中醫(yī)藥治療、靶向治療和支持治療等多種綜合治療方案，但由于多數(shù)胃癌患者診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，對(duì)其進(jìn)行臨床治療時(shí)往往效果較差，僅有20%左右的5年生存率。關(guān)于胃癌發(fā)病的確切機(jī)制目前尚未明確，而造成患者死亡的原因主要是進(jìn)展期胃癌發(fā)生的侵襲與轉(zhuǎn)移[10-12]。臨床常采用TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)對(duì)胃癌患者進(jìn)行術(shù)前評(píng)估和預(yù)后判斷，但這些指標(biāo)敏感度均較低[13,14]。因此，尋求一種可以控制胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)胃癌治療的進(jìn)展就顯得尤為重要。

PDK-1是一類促癌基因，有21個(gè)外顯子，被研究者定位與5q21染色兔中，編碼一個(gè)300 kD分子量、由556個(gè)氨基酸組成，屬于AGC蛋白激酶家族。其為一類親水性的胞聚蛋白，對(duì)細(xì)胞生長和細(xì)胞周期其調(diào)節(jié)作用。近年來，PDK-1在多種惡性腫瘤中的促癌作用已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[15]。多項(xiàng)研究表明，PDK-1表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞中，如前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等[16-18]。關(guān)于其在癌癥發(fā)展中的作用機(jī)制，主要是因?yàn)镻DK-1作為蛋白激酶B的上游信號(hào)分子，其可通過磷酸化蛋白激酶B的蘇氨酸308位點(diǎn)，激活蛋白激酶B，進(jìn)而參與PI3K/Akt信號(hào)通路的活化，抑制細(xì)胞凋亡并刺激腫瘤細(xì)胞增殖、代謝和血管生成，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19,20]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PDK-1可引發(fā)額外的信號(hào)輸出，直接誘發(fā)Polo Like激酶1的磷酸化，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[21]。本次研究中，無論在胃癌組織還是在癌旁正常組織中，PDK-1均主要表達(dá)與胃癌癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在癌組織中的表達(dá)水平均得到明顯上調(diào)，胃癌組織PDK-1蛋白陽性表達(dá)率明顯高于正常組織的陽性表達(dá)率，說明PDK-1蛋白的高表達(dá)參與了胃癌的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。同時(shí)本次研究通過檢測(cè)胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)水平，并結(jié)合入選胃癌患者的臨床和隨訪資料，發(fā)現(xiàn)年齡、分化類型、TNM分期、腫瘤直徑、浸潤程度與胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)明顯相關(guān)。這與國內(nèi)一項(xiàng)研究報(bào)告研究結(jié)果相似，但那項(xiàng)研究同時(shí)認(rèn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也與胃癌組織中PDK-1蛋白的表達(dá)有關(guān)[22]。分析其中原因可能與兩項(xiàng)研究入選病例基線的差異有關(guān)。

表2 胃癌組織中PDK-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

表3 胃癌患者COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析

既往有研究表明，PDK-1和惡性腫瘤的預(yù)后有關(guān)，主要通過影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力及細(xì)胞敏感性影響患者預(yù)后生存；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，通過剔除PDK-1基因可有效抑制腫瘤生長，認(rèn)為PDK-1是一個(gè)可行的惡性腫瘤治療靶點(diǎn)[23]。國外有研究通過應(yīng)用miRNA微陣列芯片來研究胃癌患者的臨床特征，發(fā)現(xiàn)大部分胃癌患者的miR-375表達(dá)水平呈下調(diào)狀態(tài)，PDK-1作為miR-375的靶基因之一，通過下調(diào)miR-375可以抑制PDK-1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤凋亡[24]。在本次研究中所選胃癌患者隨訪存活1～72個(gè)月，中位生存期37個(gè)月，術(shù)后5年生存者共34例，生存率35.42%(34/96)。不同PDK-1蛋白的表達(dá)水平患者生存情況：(1)PDK-1蛋白低表達(dá)患者隨訪存活1～72個(gè)月，中位生存期為61個(gè)月，術(shù)后5年存活率分別為70.83%；(2)PDK-1蛋白高表達(dá)患者隨訪存活1～64個(gè)月，中位生存期為33個(gè)月；術(shù)后5年存活率分別為15.63%。PDK-1蛋白高表達(dá)患者術(shù)后5年存活率明顯低于PDK-1蛋白低表達(dá)患者(P<0.01)。說明胃癌PDK-1蛋白低表達(dá)患者的預(yù)后明顯優(yōu)于PDK-1蛋白高表達(dá)患者。同時(shí)本次研究通過建立COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析發(fā)現(xiàn)，TNM分期、分化類型、腫瘤直徑、浸潤程度均是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且PDK-1蛋白表達(dá)也是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，說明PDK-1蛋白的表達(dá)水平可有效反映胃癌患者預(yù)后的轉(zhuǎn)歸情況，可為以后胃癌治療的有效靶點(diǎn)提供有力依據(jù)。

綜上所述，胃癌組織中的PDK-1蛋白與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)水平的高低與胃癌患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性，可作為胃癌早期診斷或潛在治療靶點(diǎn)的分子生物學(xué)指標(biāo)。本研究的不足之處在于樣本量較小，研究結(jié)果存在一定局限性。