托魯尼阿依·吐?tīng)栠d 萬(wàn)迎香 夏日瓦娜·阿巴斯

宮頸癌屬于女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，主要是由宮頸上皮內(nèi)瘤不斷發(fā)展導(dǎo)致，突破上皮下基膜對(duì)間質(zhì)進(jìn)行浸潤(rùn)，導(dǎo)致宮頸浸潤(rùn)癌產(chǎn)生[1]。研究顯示，宮頸轉(zhuǎn)化區(qū)上皮化處于過(guò)度活躍狀態(tài)，通過(guò)致癌因素的影響也容易引發(fā)宮頸浸潤(rùn)癌[2]。大多數(shù)專(zhuān)家認(rèn)為宮頸癌發(fā)生與患者的性生活紊亂、高危型HPV感染、分娩次數(shù)多等因素有關(guān)[3]。七葉皂苷鈉屬于一種三萜皂苷鈉鹽，主要用于腦水腫治療，以及創(chuàng)傷導(dǎo)致的肢體腫脹等治療。李涌泉等[4]研究指出，七葉皂化鈉的抗炎作用顯著，能夠有效的提高患者腦組織中超氧化物歧化酶活性，對(duì)新生血管、胰脂肪酶活性有抑制作用。也有研究顯示，七葉皂苷鈉在抗腫瘤方面，能夠改善其微環(huán)境，作用于多種腫瘤[5]。本文旨在研究七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌模型大鼠癌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供臨床參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 研究動(dòng)物：清潔級(jí)健康雄性SD大鼠30只[海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(粵)2012-0002]，大鼠周齡8～10周，平均(9.4±1.1)周；體重200～220 g,平均(210.5±5.4)g，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠飼養(yǎng)嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程操作，環(huán)境溫度保持于22～25℃，濕度45%～55%，每小時(shí)通風(fēng)6～10次，每天按時(shí)給水及添加飼料，每2天更換墊料1次。本研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌模型建立:參考文獻(xiàn)[6]，在無(wú)菌操作環(huán)境下進(jìn)行，將人宮頸癌Hela細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)液，溫度為37℃，5%的CO2中培養(yǎng)，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞，之后使用10%的小牛血清培養(yǎng)基將消化終止，使用1 200 r/min離心處理10 min，之后洗滌。將細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)置為107/ml，抽取人宮頸癌Hela細(xì)胞懸濁液，選取20只大鼠，在其腋窩進(jìn)行皮下注射，劑量為0.5 ml。常規(guī)飼養(yǎng)7 d，觀察腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)情況。

1.2.2 分組及給藥:20只宮頸癌模型大鼠隨機(jī)分為模型組和七葉皂苷鈉組，每組10只，正常組大鼠10只。七葉皂苷鈉組大鼠給予七葉皂苷鈉注射液皮下注射干預(yù)，劑量為40 mg/L。正常組和模型組大鼠給予等體積的無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行干預(yù)。所有大鼠連續(xù)干預(yù)4周。

1.2.3 腫瘤體積、臟器指數(shù)檢測(cè):大鼠在干預(yù)4周后斷頭處死，剝離大鼠腫瘤組織，計(jì)算腫瘤體積。取大鼠胸腺和脾臟組織，使用扭力天平稱(chēng)取大鼠大鼠胸腺和脾臟重量，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。公式：臟器指數(shù)=臟器重量/體重。

1.2.4 病理學(xué)觀察:大鼠處死后，立即提取大鼠宮頸內(nèi)膜組織標(biāo)本，使用40 ml/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣6周，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm的組織切片，HE染色，觀察。

1.2.5 宮頸癌細(xì)胞增值率、凋亡率計(jì)算:將大鼠腫瘤組織放在有少量鹽水的平皿中，使用剪刀將組織剪成勻漿，之后加入0.9%氯化鈉溶液10 ml，使用吸管將腫瘤組織吸取。先使用100目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，在使用1 000 r/min離心沉淀5 min，之后使用0.9%氯化鈉溶液清洗3次，其沉淀以500 r/min離心處理，將細(xì)胞碎片清除。使用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，使用70%的冰乙醇固定，在4℃環(huán)境中保存。采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、PI3K、pAKT蛋白檢測(cè):將采集到的血液標(biāo)本，研磨后加入蛋白緩沖液，進(jìn)行常規(guī)蛋白提取，采取BCA法進(jìn)行定量分析。50 μg的蛋白樣品上樣后SDS-PAGE電泳，通過(guò)蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜，使用5%的脫脂奶粉TBST中進(jìn)行避光封閉1 h，洗滌之后加入一抗稀釋溶液[含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、Caspase-7、Caspase-9、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)按照1∶1 000比例進(jìn)行稀釋]，在4℃的環(huán)境中過(guò)夜保存，洗滌后加入二抗稀釋溶液(Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、PI3K、pAKT按照1∶5 000比例進(jìn)行稀釋)，在溫床中孵育1 h后再次洗滌，加入發(fā)光液ECL，曝光2～3次，取重疊值。使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌模型大鼠腫瘤體積和臟器指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠腫瘤體積增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠體積增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠腫瘤體積和臟器指數(shù)比較

2.2 宮頸癌模型大鼠病理學(xué)觀察 正常組大鼠宮頸組織正常，細(xì)胞排列較為規(guī)則、整齊，結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠宮頸組織出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列紊亂；七葉皂苷鈉組大鼠宮頸組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象降低。見(jiàn)圖1。

2.3 七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌模型大鼠癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠癌細(xì)胞增殖率、凋亡率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉組大鼠癌細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

正常組模型組七葉皂苷鈉組

表2 3組大鼠癌細(xì)胞增殖率和凋亡率比較

2.4 七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌模型大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白的影響 與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，七葉皂苷鈉組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 3組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)比較

2.5 七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌模型大鼠相關(guān)通路蛋白的影響 與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠PI3K、pAKT蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，七葉皂苷鈉組大鼠PI3K、pAKT蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖3。

正常組模型組七葉皂苷鈉組

圖23組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白Western Blot圖

表4 3組大鼠PI3K、pAKT蛋白表達(dá)比較

正常組模型組七葉皂苷鈉組

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅依靠細(xì)胞增殖，還與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。凋亡細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，新細(xì)胞代替凋亡細(xì)胞，維持細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖之間的動(dòng)態(tài)平衡[7]。研究指出，凋亡細(xì)胞數(shù)量降低，會(huì)造成凋亡抑制因子表達(dá)水平升高，對(duì)凋亡因子起到抑制作用，將細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖間的動(dòng)態(tài)平衡打破，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生[6,8]。七葉皂苷鈉對(duì)人類(lèi)慢性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞以及急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞有抑制增殖作用，同時(shí)能夠提高5-氟尿嘧啶等抗腫瘤藥物殺傷能力[9,10]。目前關(guān)于七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌的作用機(jī)制尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠體積增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低，其中與模型組比較，七葉皂苷鈉組大鼠體積增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)降低，說(shuō)明七葉皂苷鈉能夠減少宮頸癌體積，抑制腫瘤生長(zhǎng)，降低胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，改大鼠癥狀。高艷等[11]在研究中指出，苦參堿能夠減少大鼠腫瘤體積，與本文研究結(jié)果保持一致，說(shuō)明七葉皂苷鈉能夠起到與苦參堿相同的作用效果。Chen等[12]研究顯示，七葉樹(shù)中發(fā)現(xiàn)的皂苷類(lèi)物質(zhì)對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和胃腸道腫瘤細(xì)胞毒性作用較強(qiáng)。也有研究顯示，七葉皂苷鈉對(duì)宮頸癌COX5細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞增殖有抑制作用，同時(shí)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13,14]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠癌細(xì)胞增殖率、凋亡率高，與模型組相比，七葉皂苷鈉組大鼠癌細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高。說(shuō)明七葉皂苷鈉能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，抑制增殖。與Wang等[15]研究結(jié)果保持一致。

Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9屬于Caspase家族重要的凋亡促進(jìn)因子，主要作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。人體中大部分細(xì)胞凋亡需要凋亡因子進(jìn)行誘導(dǎo)，凋亡促進(jìn)因子活性被抑制，會(huì)引發(fā)腫瘤。王劍等[17]研究指出，Survivin屬于一種凋亡抑制因子，其水平下調(diào)，會(huì)促進(jìn)Caspase因子上調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。Song等[18]研究中，七葉皂苷鈉干預(yù)宮頸HeLa細(xì)胞，會(huì)增加線(xiàn)粒體通透性，促進(jìn)Caspase-9激活。本文結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)降低，與模型組比較，七葉皂苷鈉組大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)升高。提示七葉皂苷鈉能夠促進(jìn)宮頸癌大鼠Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)升高，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤發(fā)展有關(guān)，PI3K屬于一種蛋白激酶，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)因子刺激后，PI3K被活化，PIP3產(chǎn)生，與細(xì)胞中的AKT結(jié)合后，AKT內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[19,20]。本文數(shù)據(jù)中，與正常組比較，模型組和七葉皂苷鈉組大鼠PI3K、pAKT蛋白表達(dá)升高。提示，七葉皂苷鈉活化PI3K/AKT，促進(jìn)Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9激活，通過(guò)有絲分裂性傳遞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制增殖。

綜上所述，七葉皂苷鈉能夠減小宮頸癌大鼠腫瘤體積，改善胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，通過(guò)激活PI3K、pAKT信號(hào)通路，調(diào)控Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9蛋白表達(dá)，起到降低癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡作用。