朝魯門 張士發(fā)

1錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧沈陽，110016；2北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院皮膚科，沈陽，110016

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(cSCC)是起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤。大多數(shù)cSCC發(fā)生在老年患者的光暴露部位，在日光性角化病(actinic keratosis，AK)基礎(chǔ)上發(fā)病。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，cSCC的發(fā)病率約為29.4%，已超過基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)成為發(fā)病率第一位的非黑素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancer，NMSC)[1]。隨著我國人口老齡化的發(fā)展和皮膚惡性腫瘤病理活檢患者的數(shù)量增多，cSCC的確診病例數(shù)亦逐年上升。除紫外線輻射外，其他危險(xiǎn)因素還包括慢性免疫抑制狀態(tài)(如人類免疫缺陷病毒感染)、慢性皮膚病、人乳頭瘤病毒感染等。cSCC早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，這不僅可增加患者負(fù)擔(dān)，也對(duì)后續(xù)的治療造成巨大挑戰(zhàn)。

然而，cSCC發(fā)生的分子機(jī)制尚不完善。有研究表明，Wnt信號(hào)通路參與了cSCC的發(fā)生和發(fā)展[2]。Wnt通路在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，它由一系列信號(hào)傳導(dǎo)蛋白組成，成員包括軸抑制蛋白(axis inhibitor factor 1，Axin1)、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，Gsk-3β)和腺瘤性息肉病腫瘤抑制基因(adenomatous polyposis coli，APC)等。分化簇82(cluster of differentiation 82，CD82)是Tetraspanin糖蛋白超家族的成員，是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。最近有研究發(fā)現(xiàn)，CD82可通過下調(diào)細(xì)胞膜上的Wnt受體來抑制Wnt信號(hào)通路。本文研究了Axin1、Gsk-3β和CD82在CSCC中的表達(dá)，探討其在CSCC中的作用。

1 資料與方法

1.1 病例資料 實(shí)驗(yàn)組取自2008年1～12月于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院沈河院區(qū)皮膚科就診的40例臨床資料完整的cSCC患者術(shù)后組織石蠟塊，對(duì)照組取自15例同期于本科室就診的良性皮膚病患者的皮膚組織。根據(jù) Broders[3]分級(jí)法將cSCC分為I～I(xiàn)V級(jí)，其中I級(jí)15例(37.5%),II級(jí)15例 (37.5%),III級(jí)10例(25%),未見IV級(jí)。術(shù)前均未進(jìn)行放、化療，既往史及過敏史無特殊。

1.2 免疫組化步驟 兔抗人Axin1單抗、Gsk-3β單抗、CD82單抗,免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。免疫組化步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作空白對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷 由兩位病理醫(yī)師在不知臨床資料的情況下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，在顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在15×20高倍鏡下觀察計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，鏡下表現(xiàn)為在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或沿細(xì)胞膜呈黃色或棕色顆粒狀沉積視為陽性表達(dá)。無陽性細(xì)胞計(jì)0分，≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。細(xì)胞染色與背景無異計(jì)0分，染色為淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。免疫組化評(píng)分=陽性細(xì)胞百分比積分×細(xì)胞染色強(qiáng)度積分。免疫組化評(píng)分>3分為免疫反應(yīng)(+)[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率比較采用卡方檢驗(yàn)與Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC及正常皮膚組織中的表達(dá) Axin1、Gsk-3β和CD82陽性信號(hào)大部分定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，少數(shù)定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞核。Axin1在cSCC和正常皮膚組織中的陽性表達(dá)率分別為42.5%、86.7%，Gsk-3β在cSCC和正常皮膚組織中的陽性表達(dá)率分別為40.0%、80.0%，CD82在cSCC和正常皮膚組織中的陽性表達(dá)率分別為35.0%、73.3%，Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC中的陽性表達(dá)率顯著低于正常皮膚組織，P值分別為0.003、0.008、0.011，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC組織的陽性表達(dá)率與正常組織相比顯著降低。見表1和圖1。

2.2 Axin1、Gsk-3β和CD82與cSCC患者各病理學(xué)特征間的關(guān)系 Axin1在cSCC I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)的陽性表達(dá)率分別為66.7%、40.0%、10.0%，Gsk-3β在cSCC I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)的陽性表達(dá)率分別為73.3%、20.0%、20.0%，CD82在cSCC I級(jí)、II級(jí)、III級(jí)的陽性表達(dá)率分別為60.0%、26.7%、10.0%，Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC中的陽性表達(dá)率III級(jí)

1a:Axin1主要分布于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，少數(shù)表達(dá)于胞膜，積分為4；1b:Gsk-3β在腫瘤細(xì)胞中染色淺，積分為2；1c：CD82在癌組織中染色淺，表達(dá)少，積分為1;1d:Axin1在表皮全層呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性染色主要定位于胞膜，積分為12；1e: Gsk-3β在基底層以上角質(zhì)形成細(xì)胞中廣泛分布，積分為6；1f:CD82在基底層以上角質(zhì)形成細(xì)胞中廣泛分布，積分為6

表2 Axin1、Gsk-3β和CD82與cSCC患者各病理學(xué)特征間的關(guān)系

2a: Axin1廣泛分布于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，積分為9；2b: Axin1分布于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，少數(shù)沿細(xì)胞膜分布，積分為6；2c:癌細(xì)胞散在染色，積分為3；2d: Gsk-3β均勻分布于癌巢，積分為6；2e: Gsk-3β均勻分布于癌巢中，積分為3；2f:腫瘤細(xì)胞未染色，積分為0；2g: CD82廣泛表達(dá)于癌巢中，積分為6；2h: CD82散在分布于癌巢，積分為2；2i: CD82在腫瘤細(xì)胞中散在染色，積分為1

2.3 Axin1、Gsk-3β和CD82在cSCC組織中表達(dá)的相關(guān)性 Axin1、Gsk-3β在cSCC中呈正相關(guān)表達(dá)(r=0.677，P<0.05)；Axin1和CD82在cSCC中的表達(dá)無相關(guān)性(P=0.596)；Gsk-3β和CD82在cSCC中的表達(dá)無相關(guān)性(P=0.671)。見表3、4、5。

表3 Axin1與Gsk-3β在cSCC組織的相關(guān)性

表4 Axin1與CD82在cSCC組織的相關(guān)性

表5 Gsk-3β與CD82在cSCC組織的相關(guān)性

3 討論

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路是皮膚發(fā)育的基礎(chǔ)，持續(xù)的Wnt信號(hào)能阻斷雞胚表皮母細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)的反應(yīng)，促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的表達(dá)，誘導(dǎo)新生皮膚上皮中角蛋白的產(chǎn)生，從而形成表皮。相反，若表皮細(xì)胞缺乏對(duì)Wnt信號(hào)的暴露，則促進(jìn)FGFs信號(hào)傳導(dǎo)，形成神經(jīng)系統(tǒng)[5]。

Wnt通路主要通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin發(fā)揮生物學(xué)功能。無Wnt信號(hào)時(shí)，Axin1作為支架蛋白與Gsk-3β和APC結(jié)合形成降解復(fù)合物，從而降解胞質(zhì)中的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)，使其保持一定的濃度。當(dāng)Wnt配體通過與細(xì)胞膜上的七跨膜受體Frizzled(FZD)和LRP5/6共受體結(jié)合激活該通路時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Dishevelled(DVL)的募集。DVL拮抗降解復(fù)合物的活性使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚積，然后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，在T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)的作用下，β-catenin引起Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄[6]。此外，被Gsk-3β磷酸化的Axin1能夠增加它自身的穩(wěn)定性，而未被磷酸化的Axin1對(duì)β-catenin的親和力較低，因此會(huì)降低它促進(jìn)β-catenin降解復(fù)合物形成的能力。研究發(fā)現(xiàn)，CD82可通過多種機(jī)制抑制Wnt信號(hào)通路。一是可以抑制β-catenin酪氨酸磷酸化，穩(wěn)定細(xì)胞膜上的E-鈣黏連蛋白(E-cadherin)-β-catenin復(fù)合物，阻止癌細(xì)胞從原發(fā)癌巢中解離，從而限制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。二是可通過下調(diào)FZD來抑制信號(hào)傳導(dǎo)。三是通過下調(diào)Gsk-3β和激酶酪蛋白激酶1α(CK1α)，抑制β-catenin在Ser45、Ser33、Ser37和Thr41的磷酸化[7]。

Axin1參與細(xì)胞生長、增殖、分化、癌變和凋亡等多種調(diào)控過程[8]。既往關(guān)于鱗癌的國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]等組織中Axin1的表達(dá)降低與不良腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等呈負(fù)相關(guān)。在皮膚病方面，梁俊琴等[11]發(fā)現(xiàn)，Axin1 mRNA在cSCC中的表達(dá)低于正常皮膚組織，且其在cSCC中的低表達(dá)與病理分級(jí)無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Axin1在cSCC中的陽性表達(dá)率顯著低于正常皮膚組織，分別為42.5%、86.7%，提示其表達(dá)降低可能與cSCC發(fā)病有關(guān)，隨著病理分級(jí)升高，其表達(dá)率逐級(jí)降低，這說明表達(dá)強(qiáng)度可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，與既往研究結(jié)果基本符合。

Gsk-3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究發(fā)現(xiàn)其在糖尿病、阿爾茲海默癥和免疫疾病等的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在皮膚病方面，Ma等[12]發(fā)現(xiàn)Gsk-3β在cSCC中的表達(dá)顯著低于鄰近的非腫瘤角質(zhì)形成細(xì)胞,說明Gsk-3β的下調(diào)或失活對(duì)表皮細(xì)胞是致癌的。然而，Ahn等[13]發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌中Gsk-3β的表達(dá)高于正常宮頸組織，提示Gsk-3β促進(jìn)了宮頸鱗癌的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，Gsk-3β在cSCC中的表達(dá)率顯著降低，分別為80.0%、40.0%，這與MA等研究者的結(jié)果一致。Gsk-3β在腫瘤中的作用受其磷酸化形式、組織中表達(dá)位置和腫瘤類型的影響，在不同腫瘤中可介導(dǎo)完全相反的腫瘤結(jié)局。

KAI1/CD82是Dong等[14]發(fā)現(xiàn)的位于染色體11p11.2上的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。CD82可抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移，與腫瘤的侵襲和預(yù)后密切相關(guān)。在多種器官鱗癌(口腔鱗癌[15]、陰莖鱗癌[16]、喉鱗癌[17]和宮頸癌[18])中，均報(bào)道了CD82的低表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。另外，在食管鱗癌中CD82的表達(dá)與病理分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[19]。在皮膚病中，CD82在增生性痣、原發(fā)性黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)逐漸降低[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常皮膚組織相比，CD82在cSCC中的表達(dá)率顯著降低，分別為73.3%、35.0%，提示其表達(dá)降低可能與cSCC發(fā)病有關(guān)，隨著病理分級(jí)升高，其表達(dá)率逐級(jí)降低，這說明表達(dá)強(qiáng)度可能與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。

在乳腺癌中，胞漿中Axin保留的表達(dá)(≥40%腫瘤細(xì)胞呈陽性染色)與Gsk-3β呈正相關(guān)[21]。陳靖等[22]研究Axin、Gsk-3β在食管癌中的作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌中Axin與Gsk-3β的表達(dá)呈正相關(guān)，從而證實(shí)了Axin、Gsk-3β在β-catenin降解復(fù)合物中的功能結(jié)合，需兩者協(xié)同作用方能有效地將β-catenin磷酸化。

△Np63a上調(diào)CD82以抑制細(xì)胞侵襲，Gsk-3β可能通過調(diào)節(jié)△Np63a-CD82軸來調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲。CD82是△Np63a(不含N-末端反式激活結(jié)構(gòu)域的P63蛋白亞型)的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，后者是在上皮細(xì)胞和鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的主要異構(gòu)體?！鱊p63a的表達(dá)抑制了Matrigel細(xì)胞的生長和癌細(xì)胞的侵襲，在很大程度上可被CD82的特異性消融所逆轉(zhuǎn)。相反，敲除△Np63a基因可增加細(xì)胞侵襲，而CD82的異位表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一過程。此外，用藥物或RNA抑制Gsk-3β活性可導(dǎo)致△Np63a和CD82表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞侵襲力增加[23]。在cSCC中，未發(fā)現(xiàn)CD82與Wnt負(fù)調(diào)節(jié)因子Axin1和Gsk-3β表達(dá)的相關(guān)性，因此，Wnt通路可能不經(jīng)過CD82促進(jìn)發(fā)病，這可能與組織特異性，且cSCC大多發(fā)生在AK的皮損上有關(guān)。

Axin1在cSCC中的低表達(dá)提示Axin1在cSCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起一定的作用，可為cSCC的早期診斷和治療提供參考。Gsk-3β在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、腫瘤生長和癌癥免疫等許多生物學(xué)過程中均發(fā)揮作用，因此靶向Gsk-3β將是一種合理的放射、化療和免疫相結(jié)合治療癌癥的策略。CD82單抗(CD82-mAb)也被證明在急性髓系白血病(AML)小鼠模型中，可將骨髓中的CD34+白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)移到外周血中，且CD82-mAb與阿糖胞苷(AraC)聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)使用AraC或CD82-mAb治療延長了攜帶人類AML細(xì)胞的免疫缺陷小鼠的生存期。

本研究證明Wnt信號(hào)通路在cSCC中有促進(jìn)作用，但詳細(xì)的分子信號(hào)傳遞過程仍需下一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。本組病例中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，因此未能研究三種蛋白在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)或遠(yuǎn)隔組織中的表達(dá)情況。下一步的實(shí)驗(yàn)需納入晚期患者，檢測β-catenin及下游信號(hào)物質(zhì)，應(yīng)用Western Blot技術(shù)進(jìn)行定量分析，CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲。晚期cSCC預(yù)后差，因此明確所涉及的分子途徑對(duì)于開發(fā)新的治療方法非常重要，本研究也為cSCC的診斷及治療提供部分理論基礎(chǔ)。