廣東醫(yī)科大學(xué)順德婦女兒童醫(yī)院（佛山市順德區(qū)婦幼保健院）（528300）麥富巨 劉鳳芝 趙卓姝

自然流產(chǎn)是現(xiàn)在多見的妊娠并發(fā)癥，常無征兆發(fā)生，也來不及挽救，發(fā)病率約15%～20%，且每年都有上升的趨勢(shì)[1]。其發(fā)病原因與遺傳學(xué)因素、環(huán)境因素、免疫疾病、孕婦內(nèi)分泌疾病等密切相關(guān)[2]。研究表明，胎兒染色體異常是引起早期流產(chǎn)的主要原因之一[3]。目前，絨毛等流產(chǎn)組織的核型分析是檢測(cè)染色體異常的重要方法。但絨毛細(xì)胞采樣及培養(yǎng)的要求較高，且培養(yǎng)的成功率往往較低，并且只能分辨大于5Mb左右的條帶，分辨能力有限，難以得到理想的結(jié)果[4][5]。近年來，隨著新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)的快速發(fā)展，第二代測(cè)序技術(shù)在拷貝數(shù)變異(CNVs)檢測(cè)中越來越具有可行性。本研究利用CNV-seq檢測(cè)流產(chǎn)組織，探討基因拷貝數(shù)變異與自然流產(chǎn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧分析2019年1月～12月在我院確診的自然流產(chǎn)的流產(chǎn)物186例。早期流產(chǎn)138例，中晚期流產(chǎn)48例；患者年齡20～44歲，平均（31.74±5.29）歲，其中高齡孕婦58例；孕周5～36周，平均為（10.98±4.89）周。檢測(cè)均獲患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，并通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 患者均在知情同意的情況下，行人工流產(chǎn)術(shù)，采集流產(chǎn)組織約5～10g，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗后，放入15mL離心試管內(nèi)冷凍保存，其中絨毛組織181份，臍帶組織2份，皮膚組織3份；抽取病患3mL抗凝血（EDTA抗凝）用于進(jìn)行母源污染檢測(cè)，將所有樣本送至湖南家輝遺傳?？漆t(yī)院進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 DNA提取與測(cè)序 提取流產(chǎn)組織10mg，用生理鹽水反復(fù)沖洗后進(jìn)行DNA提取并檢測(cè)所得DNA的濃度、純度以及DNA片段的完整性。將檢驗(yàn)合格的DNA基因組，隨機(jī)打斷成小片段核酸，采用北京貝瑞和康的高通量測(cè)序文庫(kù)試劑盒，通過末端修復(fù)，接頭連接等方式構(gòu)建文庫(kù)；構(gòu)建的文庫(kù)采用KAPASYBR FAST qPCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，檢測(cè)合格后，使用Illumina平臺(tái)的Nextseq CN 500高通量測(cè)序儀進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序[6]。將所得的測(cè)序Reads與人類參考基因組(grch37/h919)進(jìn)行匹配。為了確定CNVs的意義，筆者將篩選待測(cè)樣本DNA重復(fù)或缺失區(qū)域的檢測(cè)數(shù)據(jù)，并與DGV、Decipher、OMIM、UCSCs、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。此外，使用STR分析方法檢測(cè)母體血液DNA和流產(chǎn)組織DNA，獲得母源污染的概率。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件分析觀察項(xiàng)數(shù)據(jù)，采用百分率（%）表示計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料通過χ2檢驗(yàn)表示。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 在不同孕期的染色體異常檢測(cè)結(jié)果＜12周的流產(chǎn)胚胎染色體異常約為47.10%（65/138），≥12周的流產(chǎn)及死胎染色體異常約為29.17%（14/48），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見附表1。

2.2 在不同年齡段的染色體異常檢測(cè)結(jié)果 年齡在35歲以下病患的流產(chǎn)組織染色體異常率為39.06%（50/128），大于等于35歲高年齡患者流產(chǎn)組織染色體異常約為53.45%（31/58），但兩組間染色體異常率差異無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見附表2。

2.3 染色體非整倍體檢驗(yàn)情況流產(chǎn)組織染色體異常中共有非整倍體異常83例，其中單體16例，14例為45,X，2例分別為45,X[20%]/46,XN[80%]嵌合體和45,XN,-3[40%]/46,XN[60%]嵌合體；共有52例三體型，涉及除1，3，4，6，7，10，11，12，19外的染色體，而占比在前三位分別是22三體、16三體及18三體?；颊咧杏?例為雙三體，染色體多倍體涉及病患11例。同時(shí)，83例病患中涉及到嵌合體非整倍體6例，異常嵌合占比為20%～80%。具體見附表3。

2.4 染色體基因組微缺失/微重復(fù)變異檢測(cè)情況 使用CNVs分析對(duì)186例樣本開展檢測(cè)的結(jié)果如下，62例樣本中檢出CNVs：微缺失8例，微重復(fù)42例，有12例病例為微缺失合并微重復(fù)；CNVs合并非整倍體異常共有11例。62例具有CNVs樣本中37例為1處CNVs，9例為2處CNVs，4例為3處CNVs，1例為4處CNVs；62例CNVs具體分類情況見附表4。

附表1 不同孕周染色體異常檢查結(jié)果（例）

附表2 不同年齡段染色體異常檢查結(jié)果（例）

附表3 流產(chǎn)物染色體非整倍體、多倍體及正倍體異常情況

附表4 62例微缺失/微重復(fù)結(jié)果分類

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，流產(chǎn)原因中遺傳方面占比高達(dá)50%～60%，染色體異常則為遺傳導(dǎo)致流產(chǎn)的最多見的原因。近年來，染色體異常的檢測(cè)方法更加多樣化，如MLPA、FISH，流產(chǎn)組織的檢測(cè)也采用SNParray、arrayCGH方式，擴(kuò)大了染色體異?？蓹z測(cè)的范圍。目前，低深度的CNV-seq被廣泛應(yīng)用，隨著未來測(cè)序深度的增加，CNV-seq將取代微陣列技術(shù)，成為一種更可擴(kuò)展、更經(jīng)濟(jì)的常規(guī)染色體疾病檢測(cè)技術(shù)。186例成功標(biāo)本中，染色體數(shù)目異常者83例；微缺失和微重復(fù)綜合征5例，多態(tài)性4例，致病性不明者53例。流產(chǎn)胚胎的主要原因仍然是染色體非整倍體改變，大多為染色體三體及45,X的單體，而除45,X外的其他染色體單體較為少見；大部分染色體都會(huì)發(fā)生染色體增加，染色體增加發(fā)生率最高的是22號(hào)染色體，其他染色體概率相當(dāng)，而并不是集中發(fā)生于21號(hào)、13號(hào)、18號(hào)染色體。對(duì)此，臨床中一度對(duì)流產(chǎn)組織進(jìn)行FISH分析，但是因?yàn)槟苡玫膬H有染色體13、18、21、X、Y的探針，所用的探針有限，所以用此種方法分析流產(chǎn)組織的檢出率非常有限，效果不理想。本研究共檢出6例嵌合體，分別是45,X[20%]/46,XN[80%]，45,XN,-3[40%]/46,XN[60%]，47,XN,+20[40%]/46,XN[60%]，48,XN，+16,+18[70%]/47,XN,+18[30%]，68,XNN,-11[70%]/69,XNN[30%]，47,XN,+16[80%]/46,X,+16[20%]，證明了高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)嵌合體的高敏感性，能對(duì)20%的嵌合體做到有效檢出，有國(guó)內(nèi)外研究CNV-seq甚至可發(fā)現(xiàn)5%的嵌合體。

由于高通量測(cè)序技術(shù)的高靈敏度和高分辨率，在能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)染色體非整倍體的同時(shí)，也能夠檢測(cè)到不小于100Kb的微缺失和微重復(fù)。本研究結(jié)果顯示，186例流產(chǎn)樣本中發(fā)現(xiàn)致病性未知的CNVs 53例，致病性CNVs5例和多態(tài)性的CNVs4例。檢測(cè)結(jié)果中致病力未知的CNVs的占比最大，在臨床實(shí)際使用中，利用高通量測(cè)序技術(shù)檢出的數(shù)量眾多的致病力未知的遺傳信息仍存在爭(zhēng)議。高通量測(cè)序結(jié)果的遺傳咨詢和解釋是目前臨床遺傳咨詢面臨的難題，對(duì)臨床工作者來說是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

染色體異常與流產(chǎn)時(shí)間具有相關(guān)性，根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析186例流產(chǎn)時(shí)間和染色體異常相關(guān)，發(fā)現(xiàn)染色體異常的懷孕前12周流產(chǎn)的占47.10%，而大于12周的流產(chǎn)及死胎染色體異常占29.17%，兩組數(shù)據(jù)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明染色體異常是早期胚胎損失最重要的原因之一。有專家的相關(guān)研究顯示，35歲以上孕婦的染色體異常發(fā)生率高達(dá)68.38%，較35歲以下孕婦的56.24%顯著較高。本研究結(jié)果顯示大于35歲的染色體異常率為（53.45%），而小于35歲組的染色體異常率為（39.06%），但兩組數(shù)據(jù)無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示大于35歲孕婦的染色體異常發(fā)生率雖有所升高，但因?yàn)闃颖玖康仍颍杂斜匾枰赃M(jìn)一步研究。

通過本研究，筆者發(fā)現(xiàn)高通量測(cè)序技術(shù)可以在覆蓋全基因組時(shí)檢測(cè)基因組拷貝數(shù)的變化。除了檢測(cè)染色體非整倍體的變化外，還可以檢測(cè)常規(guī)核型分析無法發(fā)現(xiàn)的致病性微失衡，發(fā)現(xiàn)致病性和可能致病性的CNVs，可以顯著提高異常的檢出率。