盧峰，羅志剛，李甫罡，王鋼，陳濤，郭曉蘭

(1.簡(jiǎn)陽市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，四川簡(jiǎn)陽 641400；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637100)

B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)是非霍奇金淋巴瘤中常見的一種類型(約占80%)[1]。B-NHL的組織類型多樣，臨床上通過形態(tài)學(xué)結(jié)合免疫組化染色可確診70%～80%的病例，但仍有20%～30%的患者與反應(yīng)性淋巴組織增殖疾病(例如淋巴結(jié)炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥等)難以區(qū)別[2]。免疫球蛋白(Ig)的克隆性基因重排是B-NHL的特征之一，利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因重排是臨床上檢測(cè)B-NHL的主要手段之一。研究證實(shí)，使用BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測(cè)病理組織和骨髓樣本Ig基因重排具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于外周血標(biāo)本Ig基因重排的相關(guān)研究主要集中于濾泡淋巴瘤(FL)及部分T細(xì)胞淋巴瘤[4-5]，而將外周血與骨髓標(biāo)本Ig基因重排進(jìn)行比較的報(bào)道較少。本研究擬采用多重聚合酶鏈反應(yīng)(mPCR)技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)化BIOMED-2引物系統(tǒng)對(duì)B-NHL患者骨髓或(和)外周血標(biāo)本進(jìn)行Ig基因重排檢測(cè)，比較其陽性率，以期探討外周血標(biāo)本檢測(cè)Ig基因重排的可行性。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 收集2017年1月至2018年12月于簡(jiǎn)陽市人民醫(yī)院血液科及腫瘤科就診的103例B-NHL患者作為研究對(duì)象，其中男58例，女45例，年齡27～78歲，中位年齡61.2歲。均根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織《造血和淋巴組織腫瘤分類》明確診斷[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：治療期間出院、病歷資料不全或者伴有其他系統(tǒng)惡性腫瘤的患者。按組織學(xué)分類分為慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)/小B細(xì)胞淋巴瘤(SLL)59例，套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)9例，彌漫大B細(xì)胞性淋巴瘤(DLBCL)14例，濾泡淋巴瘤(FL)5例，邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)4例，淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤(LPL)7例，其余5例B-NHL類型未定。另收集同期就診的20例臨床明確診斷為反應(yīng)性淋巴組織增生(包括淋巴結(jié)炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥等)的患者作為對(duì)照組，其中男12例，女8例，年齡15～62歲，中位年齡52.3歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：簡(jiǎn)醫(yī)倫理2017041)，各研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要試劑和儀器 Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒、PCR Mix、DNA Marker、BIOMED-2引物系統(tǒng)(上海生工公司)。C1000 Touch PCR儀、電泳儀、ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Nano Drop超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.3標(biāo)本采集 收集兩組患者入院時(shí)空腹外周血標(biāo)本3～5 mL，置于EDTA-K2抗凝管中待測(cè)；骨髓標(biāo)本采集由臨床醫(yī)師行髂后上棘穿刺抽取3～5 mL，置于肝素抗凝管中待測(cè)。樣本均置于4 ℃保存，24 h內(nèi)完成DNA提取。

1.4方法

1.4.1DNA提取 按照Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒說明書提取骨髓及外周血標(biāo)本DNA。采用Nano Drop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取DNA樣本的純度與濃度，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.0的DNA樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)不純或濃度不足的樣本重新提取DNA。DNA樣本短期置于-20 ℃保存，或置于-80 ℃長(zhǎng)期凍存。

1.4.2引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng) 引物設(shè)計(jì)根據(jù)BIOMED-2引物系統(tǒng)[3]，將48條引物組合在7組引物管中，具體分組見表1。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括PCR Mix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，100 μmol/L引物0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足體積。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性7 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取上述擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，4S Green Plus核酸染料染色，并于ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)上掃描并分析。結(jié)果判讀：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后，電泳條帶清晰，邊緣整齊，寬度<1 mm,條帶在預(yù)期的范圍以內(nèi)判斷為克隆性重排。如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)片狀彌散性條帶，且片段大小不在引物設(shè)計(jì)所預(yù)期的范圍以內(nèi)，為非克隆性重排。

表1 BIOMED-2引物系統(tǒng)

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，定性數(shù)據(jù)以率表示，各組之間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1B-NHL患者Ig基因單克隆重排檢測(cè) CLL/SLL與非CLL/SLL型B-NHL患者兩組間IgH、IgK、IgH和IgK聯(lián)合檢測(cè)的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.62，P=0.01；χ2=8.26，P=0.004；χ2=21.6，P=0.00)。MCL與DLBCL型的IgH、IgK、IgH和IgK聯(lián)合檢測(cè)的陽性率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.66，P=0.01；χ2=4.41，P=0.036；χ2=6.63，P=0.01)。MCL與FL、MZL、LPL型比較，IgH和IgK重排陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。20例反應(yīng)性淋巴組織增生患者均未檢出Ig重排。見圖1、表2。

表2 B-NHL患者Ig基因單克隆重排檢測(cè)[n(%)]

2.2骨髓和外周血標(biāo)本Ig基因重排檢測(cè) 70例患者外周血Ig基因重排陽性32例(45.7%)，骨髓Ig基因重排檢測(cè)陽性38例(54.3%)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.03，P=0.31)。其中CLL/SLL患者外周血與骨髓標(biāo)本Ig基因重排陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(69.2% vs 80.8%，χ2=0.92，P=0.34)；非CLL/SLL的B-NHL患者外周血與骨髓標(biāo)本Ig基因重排陽性率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(31.8% vs 38.6%，χ2=0.45，P=0.50)。見表3。

表3 骨髓和外周血標(biāo)本Ig基因重排檢測(cè)[n(%)]

3 討論

B淋巴細(xì)胞免疫球蛋白基因由可變區(qū)(variable region,V)、多變區(qū)(diversity region,D)、鉸鏈區(qū)(joining region,J)、恒定區(qū)(constant region,C)組成。在B淋巴細(xì)胞分化發(fā)育過程中，VDJ區(qū)染色體分布呈不連續(xù)狀態(tài)，片段之間可有單核苷酸隨機(jī)插入的過程。通常情況下正常人體淋巴細(xì)胞和反應(yīng)性淋巴組織增生病變中Ig重排方式多樣(即為多克隆重排)。而B-NHL患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞起源于同一克隆，表現(xiàn)為Ig單克隆重排。因此Ig克隆性重排檢測(cè)可用于B-NHL的輔助診斷[7-8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，103例B-NHL患者中IgH基因重排陽性率為41.7%，IgK基因重排陽性率為50.5%，IgH和IgK聯(lián)合檢出率為64.1%。這與肖穎等[9]報(bào)道的陽性率(65.7%)一致，但低于張巖等[2]報(bào)道的聯(lián)合檢測(cè)率(81.6%)。考慮到B-NHL的異質(zhì)性，不同亞型的B-NHL增殖、播散特點(diǎn)不同，除CLL/SLL以外的B-NHL早期病變可能局限于淋巴結(jié)，到進(jìn)展期或者晚期才出現(xiàn)結(jié)外或骨髓浸潤(rùn)，導(dǎo)致骨髓Ig基因重排檢測(cè)陽性率存在差異。本研究中20例反應(yīng)性淋巴組織增生患者未檢測(cè)出Ig基因重排，說明BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測(cè)Ig基因重排具有較高的特異性。本研究還發(fā)現(xiàn)，生發(fā)中心來源的DLBCL其IgH單克隆重排陽性率低于生發(fā)中心以前來源的MCL的IgH單克隆重排，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)也觀察到FL、MZL、LPL等生發(fā)中心以后來源的B-NHL其IgH單克隆重排陽性率低于MCL，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，生發(fā)中心V區(qū)基因體細(xì)胞高頻突變(somatic hypermutation，SHM)可降低引物的退火效率，影響引物與基因的有效結(jié)合，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗，而來源于生發(fā)中心以前的MCL幾乎不會(huì)受到SHM影響[10]。本研究中MCL患者IgH單克隆重排陽性率明顯高于DLBCL、FL、MZL、LPL，分析原因可能是由于MCL患者的腫瘤細(xì)胞來源于生發(fā)中心以前，并未與抗原接觸，較少受SHM影響，因此檢出率較高。此外，BIOMED-2引物系統(tǒng)同時(shí)包含了IgH和IgK檢測(cè)，IgK很少受體細(xì)胞超突變的影響[11]，在一定程度上可以彌補(bǔ)SHM帶來的缺陷。兩者聯(lián)合檢測(cè)可以提高Ig基因重排的檢出率。

以創(chuàng)傷性更小的血液標(biāo)本代替骨髓標(biāo)本Ig基因重排檢測(cè)是現(xiàn)今研究的目標(biāo)。研究表明，淋巴組織中的正常淋巴細(xì)胞有歸巢現(xiàn)象，淋巴結(jié)組織中的淋巴細(xì)胞可以不斷地進(jìn)入血液循環(huán)中，然后又回到淋巴組織，因此，B-NHL腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞一樣，亦具有歸巢現(xiàn)象[12-13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，治療后的B-NHL患者骨髓中殘留的腫瘤細(xì)胞并不高于外周血，這可能是由于使用造血刺激因子后造血干細(xì)胞被動(dòng)員到外周血，而腫瘤細(xì)胞也隨之進(jìn)入外周血循環(huán)[14]。本研究中骨髓與外周血標(biāo)本Ig基因重排的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明外周血標(biāo)本檢測(cè)Ig基因重排在B-NHL診斷中的價(jià)值與骨髓標(biāo)本檢測(cè)Ig基因重排基本相當(dāng)。臨床上有些病例高度懷疑淋巴瘤，但又沒有淺表的病理組織可取或者患者不愿意做診斷性穿刺而導(dǎo)致診斷困難, 此時(shí)骨髓和外周血標(biāo)本Ig基因重排檢測(cè)可以為淋巴瘤的診斷提供重要的依據(jù)。而外周血標(biāo)本Ig基因重排檢測(cè)相對(duì)無創(chuàng)、方便取材、患者痛苦少、便于隨訪，易于臨床推廣，可以作為骨髓標(biāo)本檢測(cè)Ig基因重排的有效補(bǔ)充。

綜上所述，應(yīng)用BIOMED-2引物系統(tǒng)檢測(cè)Ig基因重排可作為B淋巴細(xì)胞來源的良、惡性疾病的輔助診斷手段。外周血與骨髓標(biāo)本Ig基因重排檢測(cè)在B-NHL臨床診斷中的價(jià)值相當(dāng)。但是本研究未能將病理組織樣本納入檢測(cè)范圍，對(duì)外周血、骨髓標(biāo)本基因重排陽性吻合度存在的差異也沒有進(jìn)一步深入探討，后續(xù)研究會(huì)將病理組織和穿刺液標(biāo)本納入探討范圍，分析不同樣本來源的Ig基因重排檢測(cè)結(jié)果的差異。