葛倩文 吳尚農(nóng) 王宏剛 沈 鵬

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種非特異性的慢性結(jié)腸炎性疾病，主要表現(xiàn)為反復(fù)性或持續(xù)性腹瀉、便血及腹痛等[1-2]。近年來，全球UC的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量和生命安全[3]。UC具有病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[4]，目前UC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。探究UC的病因并針對(duì)病因?qū)ふ矣行У闹委煼桨福瑢?duì)于UC的治療及預(yù)后具有重要意義。Toll樣受體4(TLR4)可通過核因子-κB(NF-κB)調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[5]。此外有研究表明，TLR4可通過介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢，參與UC的發(fā)病及病情進(jìn)展過程[6]。TLR4在多種疾病中均可與受體型蛋白酪氨酸磷酸酶O(PTPRO)相互作用，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[7-8]。目前關(guān)于PTPRO參與UC發(fā)病的報(bào)道較少，本文對(duì)此展開研究，以期闡明PTPRO與UC的關(guān)系，為UC的臨床治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2014年4月至2017年8月在淮安市第一人民醫(yī)院就診的95例UC患者作為研究對(duì)象，設(shè)為UC組。根據(jù)《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2012年·廣州)》[9]進(jìn)行UC診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初次就診并診斷為UC；(2)患者年齡為18～60歲；(3)結(jié)直腸鏡檢查至回盲部。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并除UC以外的其他自身免疫性疾??；(2)合并嚴(yán)重的心、肝、腎功能障礙；(3)合并惡性腫瘤；(4)急性感染性腸炎；(5)隨訪失聯(lián)。另選取本院同期行腸鏡檢查并切除腸內(nèi)息肉的46例患者作為對(duì)照組。UC組患者中男性66例，女性29例，年齡為21～58歲，平均年齡為(44.66±5.21)歲；對(duì)照組中男性35例，女性11例，年齡為19～60歲，平均年齡為(45.50±6.34)歲。兩組在性別(χ2=0.667，P=0.414)、年齡(t=0.835，P=0.405)方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本次研究中所有受試者均知情并簽署了知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集

收集所有受試者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、結(jié)直腸鏡檢查結(jié)果等信息。采用免疫比濁法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，采用間接免疫熒光法檢測(cè)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)水平。

1.3 PTPRO蛋白表達(dá)量檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)UC組織及腸息肉組織中PTPRO蛋白表達(dá)量[10]。在UC組織及腸息肉組織中滴加RIPA裂解液提取總蛋白，并進(jìn)行定量，然后滴加勻漿緩沖液，4 ℃環(huán)境下，3 500 r/min離心15 min，取上層清液。然后120 V電壓電泳100 min，轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡3次，每次5 min，之后浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10 min，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后PBS洗膜3次，每次5 min；加入一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗，室溫下孵育1 h，PBST洗3次，每次10 min，曝光顯影，用軟件ImageJ進(jìn)行光密度分析。

1.4 UC鏡下活動(dòng)度

根據(jù)UC鏡下嚴(yán)重程度指數(shù)(UCEIS)評(píng)估UC鏡下活動(dòng)度[11]。UCEIS評(píng)分根據(jù)受累腸段最嚴(yán)重處血管紋理、出血情況及糜爛和潰瘍程度進(jìn)行計(jì)算。血管紋理評(píng)分：血管紋理正常計(jì)0分，斑片狀計(jì)1分，完全閉塞計(jì)2分。出血情況：黏膜和腸腔無出血計(jì)0分，輕度出血計(jì)1分，中度出血計(jì)2分，重度出血計(jì)3分。糜爛和潰瘍程度：無糜爛或潰瘍計(jì)0分，糜爛計(jì)1分，淺表糜爛和潰瘍計(jì)2分，深部糜爛和潰瘍計(jì)3分。上述3項(xiàng)評(píng)分總和即為UCEIS評(píng)分，<2分為鏡下緩解期，2～8分為鏡下活動(dòng)期。

1.5 預(yù)后隨訪

于UC患者出院后1周開始電話隨訪，隨訪為期2年，每月隨訪1次，末次隨訪時(shí)間為2019年8月26日。若隨訪過程中患者出現(xiàn)UC復(fù)發(fā)、結(jié)腸大出血、中毒性巨結(jié)腸、UC相關(guān)黏膜發(fā)育異常及UC相關(guān)癌變，則判定為預(yù)后不良[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PTPRO在UC組織中的表達(dá)

蛋白質(zhì)免疫印跡法結(jié)果顯示，UC組PTPRO蛋白表達(dá)量為3.21±0.88，高于對(duì)照組(1.14±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=21.573，P<0.001)。

2.2 PTPRO與UC鏡下活動(dòng)度的關(guān)系

95例UC患者中有35例為鏡下緩解期，60例為鏡下活動(dòng)期。鏡下緩解期UC患者PTPRO蛋白表達(dá)量為2.45±0.55，低于鏡下活動(dòng)期UC患者(3.65±0.73)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.053，P<0.001)。UC組織中PTPRO蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)鏡下活動(dòng)度的ROC曲線下面積(AUC)為0.899(95%CI：0.820～0.952)，最大約登指數(shù)為0.641，其最佳截?cái)帱c(diǎn)、敏感度及特異度分別為3.02、85.71%和78.33%。見圖1。

圖1 PTPRO蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)鏡下活動(dòng)度的ROC曲線

2.3 不同預(yù)后UC患者PTPRO蛋白表達(dá)情況

95例UC患者中32例(33.68%)預(yù)后不良，其中29例(30.53%)復(fù)發(fā)，2例(2.11%)結(jié)腸大出血，1例(1.05%)癌變。預(yù)后良好組PTPRO蛋白表達(dá)量為2.74±0.63，低于預(yù)后不良組(4.13±0.51)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.889，P<0.001)。PTPRO蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)UC患者預(yù)后的ROC AUC為0.957(95%CI：0.895～0.988)，最大約登指數(shù)為0.811，其最佳截?cái)帱c(diǎn)、敏感度及特異度分別為3.48、93.75%和87.30%。具體見圖2。

圖2 PTPRO蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)UC患者預(yù)后的ROC曲線

2.4 不同預(yù)后的UC患者基本資料比較

預(yù)后不良組和預(yù)后良好組患者在年齡、性別、BMI及病變位置方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。預(yù)后不良組患者的UCEIS評(píng)分、CRP及ANCA陽(yáng)性占比均高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。具體見表1。

2.5 影響UC患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

將UC患者的預(yù)后情況作為因變量，將可能影響UC患者預(yù)后的相關(guān)因素如PTPRO、UCEIS評(píng)分、CRP和ANCA作為自變量(納入標(biāo)準(zhǔn)為單因素分析結(jié)果中P≤0.1的因素)，納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示PTPRO、UCEIS評(píng)分及ANCA與UC患者的預(yù)后關(guān)系密切。見表2。

表1 預(yù)后不良組和預(yù)后良好組的基本資料比較

表2 影響UC患者預(yù)后的相關(guān)因素分析

3 討論

PTPRO是磷酸酪氨酸磷酸酶的受體之一，可在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[13]。此外，在巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有截短型PTPRO表達(dá)[14]。有研究表明，PTPRO可通過調(diào)控NF-κB參與肝臟缺血再灌注損傷[15]。UC是一種非特異性的慢性結(jié)腸炎性疾病，其發(fā)病及進(jìn)展與TLR4表達(dá)失衡有關(guān)，PTPRO可通過調(diào)控TLR4參與多種疾病的進(jìn)展過程[7-8]，由此推測(cè)，PTPRO可能通過調(diào)控TLR4表達(dá)，參與了UC的發(fā)生、發(fā)展過程。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UC組PTPRO蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，提示PTPRO蛋白可能參與了UC的發(fā)病或疾病進(jìn)展過程。通過比較不同鏡下活動(dòng)度UC患者PTPRO蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)鏡下活動(dòng)期患者PTPRO蛋白表達(dá)量高于鏡下緩解期患者，進(jìn)一步證實(shí)上述推測(cè)。通過構(gòu)建PTPRO蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)UC患者鏡下活動(dòng)度的ROC曲線，結(jié)果顯示其ROC AUC大于0.8，且敏感度和特異度均較好。上述結(jié)果表明，PTPRO蛋白參與了UC的疾病發(fā)生、發(fā)展過程，檢測(cè)其表達(dá)量有助于評(píng)估UC鏡下活動(dòng)度。此外，本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組PTPRO蛋白表達(dá)量低于預(yù)后不良組，提示PTPRO蛋白表達(dá)量可能與UC患者的預(yù)后關(guān)系密切。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了PTPRO蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià)UC患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示其ROC AUC、敏感度及特異度分別為0.957、93.75%和87.30%，表明PTPRO蛋白表達(dá)量在UC患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值較高，且具有較高的敏感度和特異度。通過單因素和Logistic回歸方法分析影響UC患者預(yù)后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示UCEIS評(píng)分、ANCA與UC患者的預(yù)后關(guān)系密切，與已報(bào)道的研究結(jié)論相似[16-18]。此外，本研究指出PTPRO蛋白表達(dá)量也與UC患者的預(yù)后存在一定關(guān)系。

PTPRO與TLR4相互作用參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，如爆發(fā)性肝炎、急性肝損傷及肝細(xì)胞癌等[7-8]。在上述疾病模型中，PTPRO對(duì)TLR4的調(diào)節(jié)均依賴NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TLR4表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞等，還可表達(dá)于除自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞以外的免疫細(xì)胞中[19]。TLR4對(duì)脂多糖較為敏感，可介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁中脂多糖的高反應(yīng)性[20]。TLR4可激活NF-κB，促使細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α，從而參與炎性反應(yīng)[21]。腸-肝軸異常會(huì)誘發(fā)肝、膽及腸道疾病，如原發(fā)性硬化性膽管炎的發(fā)病與UC有關(guān)[22-23]；腸道炎性疾病會(huì)增加腸上皮黏膜通透性，使病原體通過腸道進(jìn)入門靜脈，并隨血液循環(huán)至肝臟，最終引發(fā)肝臟疾病[24]。TLR4在健康人群的結(jié)腸黏膜組織中表達(dá)水平較低，但在UC黏膜組織中表達(dá)水平較高[25]。有研究表明，TLR4可通過白細(xì)胞介素-1受體(IL-1R)同源結(jié)構(gòu)域及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子髓樣分化因子88、IL-1R相關(guān)激酶、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6等，參與病原體誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞中NF-κB的活化，促進(jìn)免疫炎性因子分泌，導(dǎo)致UC發(fā)生[19]。

綜上所述，PTPRO蛋白在UC組織中高表達(dá)，檢測(cè)其表達(dá)量有助于評(píng)估UC患者鏡下活動(dòng)度及預(yù)后情況。本文尚存在一定不足，如樣本量偏小，未進(jìn)一步分析確認(rèn)PTPRO是否通過調(diào)控TLR4影響UC的預(yù)后等，下一步將探究PTPRO參與UC發(fā)病及進(jìn)展的病理生理機(jī)制，為其靶向藥物的研制提供參考。