關(guān)少培 羅 茜 吳建軍 卞兆連

肝細胞癌(HCC)是常見的肝臟惡性腫瘤，其發(fā)病率居全球第5位，是全球男性第2位致死性疾病[1]。中國是HCC高發(fā)的國家，江蘇南通等東部沿海地區(qū)是中國的HCC高發(fā)地區(qū)[2]。由于HCC起病隱匿，惡性程度高，病情進展快，極易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，故多數(shù)患者確診時已處于中、晚期。目前HCC的病因及發(fā)病機制尚未完全明確，乙型肝炎病毒(HBV)感染、乙醇、遺傳等因素都與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。臨床上常規(guī)對手術(shù)中切除的HCC組織標本進行p53等分子的免疫組織化學檢測，以期判斷預(yù)后，但這些分子的敏感度、特異度不高，預(yù)后判斷效果并不理想。因此，研究HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找潛在的預(yù)后標志物顯得尤為重要。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一類具有共價閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，因缺乏5′端和3′端，故circRNA比一般的線性RNA更穩(wěn)定，不易被降解。根據(jù)基因組和序列組成的來源，circRNA分為3類：外顯子circRNA(ecircRNA)、內(nèi)含子circRNA(ciRNA)及外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)[4]。近年來的研究表明circRNA參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括HCC、胃癌、非小細胞肺癌、結(jié)直腸癌等[5-8]。

Hsa_circ_0012839來源于PGM1基因的第9、10號外顯子，屬于ecircRNA，位于chr1∶64117339-64120137，長度為319 bp。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法分析組織、細胞中hsa_circ_0012839的相對表達水平，結(jié)合患者術(shù)后隨訪資料，初步分析其表達與患者生存期之間的關(guān)系，判斷其作為潛在預(yù)后標志物的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

收集2013年9月至2018年3月在南通市第三人民醫(yī)院肝膽外科被確診為肝細胞癌(HCC)并經(jīng)手術(shù)切除的48例患者的腫瘤組織及癌旁正常組織(距離腫瘤切緣>1 cm)，其中男性36例，女性12例，平均年齡(58.38±11.22)歲。納入標準：經(jīng)手術(shù)后病理確診為HCC。排除標準：(1)病歷資料不完整；(2)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(3)合并其他臟器嚴重功能不全；(4)隨訪時間<6個月。

所有組織標本離體0.5 h內(nèi)浸泡于RNA later中，過夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。正常肝細胞系L-02細胞和5種HCC細胞系(Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細胞)購自上海中科院干細胞庫，由南通市肝病研究所培養(yǎng)并傳代；RPMI-1640、高糖DMEM、MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液購自美國賽默飛公司，胎牛血清購自美國Cell Sciences公司；RNAiso Plus試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

收集患者的臨床資料，隨訪術(shù)后患者，記錄患者的生存狀況。所有患者均隨訪至2018年9月或死亡。 所有患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 瓊脂糖凝膠電泳

配置1%瓊脂糖凝膠，室溫下靜置至完全凝固，移液器吸取樣本加至每孔內(nèi)，加樣后立即通電進行電泳，電壓80 V，樣品由負極向正極流動，當溴酚藍移動至距離膠板下緣1 cm時停止電泳，于紫外線下采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3 總RNA的提取及qRT-PCR檢測

使用RNAiso Plus抽提HCC組織、癌旁正常組織以及L-02、Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細胞中總RNA后，應(yīng)用NanoDrop-One分光光度計檢測RNA的純度和濃度。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，根據(jù)說明書在冰上配制反應(yīng)體系。輕柔混勻后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，冷卻至4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用qRT-PCR法檢測hsa_circ_0012839的相對表達水平，反應(yīng)條件：第一步預(yù)變性，95 ℃ 30 s；第二步PCR，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct表示計算結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

本研究采用IBM SPSS Statistics 24及GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Hsa_circ_0012839的成環(huán)性分析

應(yīng)用背靠背、頭碰頭引物，通過瓊脂糖凝膠電泳分析hsa_circ_0012839的成環(huán)性。背靠背引物只可擴增環(huán)狀分子，頭碰頭引物既可擴增環(huán)狀分子，也可擴增線性分子。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，hsa_circ_0012839既可被背靠背引物擴增，也可被頭碰頭引物擴增，而GAPDH為線性內(nèi)參，只能被頭碰頭引物擴增，不能被背靠背引物擴增，表明hsa_circ_0012839為環(huán)狀RNA。見圖1。

注：背為背靠背引物，頭為頭碰頭引物，cDNA為拷貝DNA，gDNA為基因組DNA

2.2 Hsa_circ_0012839在HCC組織及癌旁正常組織中的表達水平比較

通過qRT-PCR法測得HCC組織和癌旁正常組織中hsa_circ_0012839的表達水平分別為0.51±0.50和4.94±9.91，HCC組織中hsa_circ_0012839的表達水平低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)。見圖2。

圖2 Hsa_circ_0012839在HCC組織和癌旁正常組織中的表達水平比較

2.3 Hsa_circ_0012839在細胞中的表達水平比較

通過qRT-PCR法檢測細胞中hsa_circ_0012839的表達水平，結(jié)果顯示，與正常肝細胞系L-02細胞相比，5種HCC細胞系Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細胞中hsa_circ_0012839的表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中PLC/PRF/5細胞中hsa_circ_0012839的表達水平最高，Hep3B細胞中hsa_circ_0012839的表達水平最低。見圖3。

注：與L-02細胞相比，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1

2.4 Hsa_circ_0012839表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)hsa_circ_0012839的相對表達量(HCC組織/配對癌旁組織)，以比值=0.122 3為界限將HCC患者分為高表達組和低表達組。術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，與高表達組相比，hsa_circ_0012839低表達組的預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011 6)。見圖4。

圖4 Hsa_circ_0012839表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

二代測序的普及推進了RNA研究領(lǐng)域的快速發(fā)展。CircRNA在腫瘤基因組學中備受關(guān)注[9]。研究表明circRNA通過多種途徑參與細胞功能的調(diào)節(jié)。在細胞核中，由于circRNA與親本DNA存在重復(fù)序列，故當細胞核內(nèi)circRNA累積量增多時，滯留在核內(nèi)的circRNA會以“負反饋”的方式與親本DNA形成RNA︰DNA雜合鏈，直接阻斷線性同源轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致可變剪接的發(fā)生，從而改變基因的表達[10]。在細胞質(zhì)中，circRNA的表達也參與了細胞基因的調(diào)節(jié)。諸多研究均已證實，競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)可在細胞質(zhì)內(nèi)通過充當miRNA海綿競爭性結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)下游基因的表達[11]。細胞質(zhì)中的circRNA還可以與不同的蛋白質(zhì)相互作用形成特定的circRNA，繼而影響結(jié)合蛋白的作用方式，如circMbl、circFOXO3、circANRIL[12-14]。另有研究報道RNA甲基化(m6A)也可驅(qū)動circRNA翻譯成多肽[15]，但翻譯效率目前仍受較大限制。

在細胞外，CircRNA是很有前景的生物學標志物。CircRNA因其環(huán)狀閉合抗RNase的特點而被視為非常好的生物標志物。其在某些細胞分泌的外泌體中大量存在，發(fā)揮著細胞間通信的作用[16]。盡管circRNA能否在遠處組織和內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮生物學作用尚待研究，但其仍有作為潛在生物學標志物的研究價值。

近年來諸多研究表明，非編碼RNA尤其是circRNA的表達失衡可影響HCC的發(fā)生、發(fā)展，circRNA在HCC的進展中起著促癌或抑癌的作用。Yu等[17]通過RNA測序發(fā)現(xiàn)，由于受到DExH-Box螺旋酶的調(diào)控，cSMARCA5在HCC組織中低表達，cSMARCA5低表達的患者的術(shù)后總體生存率較低，腫瘤復(fù)發(fā)率較高。體外實驗證實，cSMARCA5通過海綿吸附miR-17-3p和miR-181b-5p，下調(diào)TIMP3的表達，從而抑制HCC細胞的增殖及遷移能力，提示cSMARCA5與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。Zheng等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0079929在HCC中低表達，過表達hsa_circ_0079929時，細胞生長受到抑制，細胞周期進展也受阻，進一步研究顯示hsa_circ_0079929通過PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制了細胞增殖。此外，有些circRNA在HCC中起促癌因子的作用。Huang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-100338在HCC組織中高表達，乙型肝炎相關(guān)性HCC患者的5年生存率較低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風險較高。Wang等[20]的研究表明，circRHOT1在HCC組織中表達上調(diào)并與較差的預(yù)后有關(guān)。體內(nèi)和體外研究顯示，circRHOT1通過觸發(fā)NR2F6的表達促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。上述研究表明circRNA參與HCC的多種生物學行為，circRNA具有潛在的作為生物學標志物和治療靶點的研究價值。

本研究應(yīng)用背靠背、頭碰頭引物，瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果證明了hsa_circ_0012839為環(huán)狀RNA。采用qRT-PCR法檢測HCC組織和癌旁正常組織中hsa_circ_0012839的表達水平，結(jié)果顯示前者低于后者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1)。隨后采用qRT-PCR法檢測了各細胞中hsa_circ_0012839的表達水平，結(jié)果顯示，相比于正常肝細胞系L-02細胞，5種HCC細胞系(Hep3B、HuH-7、Li-7、PLC/PRF/5、SK-HEP-1細胞)中hsa_circ_0012839的表達水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，其中PLC/PRF/5細胞中hsa_circ_0012839的表達水平最高，Hep3B細胞中hsa_circ_0012839的表達水平最低?；仡櫺苑治鯤CC術(shù)后患者的預(yù)后情況，相比于hsa_circ_0012839高表達組，hsa_circ_0012839低表達組的預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011 6)。本研究結(jié)果表明，hsa_circ_0012839參與調(diào)控HCC的發(fā)生、發(fā)展，是判斷HCC患者預(yù)后的潛在生物學標志物，但調(diào)控的具體機制有待進一步研究。