張镕宇 李伊敏 陳桂權(quán) 劉宇虎 黃妙興 陳曉春

克羅恩病(CD)是一種病因尚未明確的腸道非特異性炎性疾病，近年來其發(fā)病率逐年升高[1-2]。CD的臨床表現(xiàn)包括腹痛、便血、腹部腫脹等，部分患者可伴有貧血、營養(yǎng)不良及關(guān)節(jié)腫痛等癥狀，嚴重者可出現(xiàn)腸梗阻或穿孔等腸道結(jié)構(gòu)性損傷[3-5]。CD的炎性狀態(tài)可用于評估患者的病情，及早判定CD患者的炎性狀態(tài)，制定相適應(yīng)的治療方案，對控制病情進展，進而改善患者預(yù)后至關(guān)重要[6]。現(xiàn)有的內(nèi)鏡評價方法易受主觀因素影響，如簡單內(nèi)鏡評分及內(nèi)鏡指數(shù)等，重復(fù)性較差[7]。因此，急需尋找便捷、客觀的臨床指標界定CD患者的炎性狀態(tài)。谷胱甘肽可保護腸黏膜免受氧自由基的損傷，當谷胱甘肽表達水平降低后，游離的氧自由基刺激腸黏膜，造成腸屏障功能下降，導(dǎo)致CD的發(fā)生、發(fā)展[8]。硒結(jié)合蛋白1(SBP1)可通過降低谷胱甘肽活性，促進氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制細胞凋亡[9]。由此推測，SBP1可能參與了CD的病理生理過程。目前關(guān)于SBP1與CD患者炎性狀態(tài)及預(yù)后的報道較少，本文對此展開研究，以期為臨床評估CD患者的炎性狀態(tài)及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2016年8月至2018年8月東莞市人民醫(yī)院收治的95例CD患者作為研究對象，設(shè)為CD組。所有患者均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年·北京)》[10]。納入標準：(1)符合CD診斷標準且為初次診斷；(2)入組前未接受免疫抑制劑、抗炎類藥物等對癥治療；(3)簽署知情同意書。排除標準：(1)伴有嚴重心、肝、腎功能障礙；(2)合并消化道惡性腫瘤；(3)伴有感染性疾病或其他自身免疫性疾??；(4)妊娠期及哺乳期婦女；(5)不能配合完成隨訪。另選取同期在本院行單發(fā)結(jié)腸息肉切除術(shù)的90例患者作為息肉組。CD組中男性60例，女性35例，年齡為19～48歲，平均年齡為(27.38±5.19)歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(20.70±3.29)kg/m2。息肉組中男性51例，女性39例，年齡為18～45歲，平均年齡為(26.54±4.93)歲，BMI為(21.62±3.17)kg/m2。兩組患者在性別(χ2=0.811，P=0.368)、年齡(t=1.127，P=0.261)、BMI(t=1.935，P=0.055)方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 基本資料 收集患者的年齡、性別、BMI、吸煙、腸切除術(shù)史、治療方案和時間等。采用酶聯(lián)免疫法檢測血清C反應(yīng)蛋白(CRP)，采用魏氏法檢測紅細胞沉降率(ESR)。應(yīng)用結(jié)腸鏡檢查確定患者肛周病變、腸梗阻、病變位置(回腸末段、結(jié)腸、回結(jié)腸)、疾病行為(非穿透非狹窄、狹窄、穿透)等情況。

1.2.2 SBP1檢測 采用Western bolt法測定CD組織及息肉組織中SBP1的表達情況。收集受試者結(jié)腸鏡及病理活組織檢查標本，無菌條件下剪碎組織，液氮中研磨，在-4 ℃下4 000 r/min離心15 min，取上層清液加入蛋白酶抑制劑提取組織蛋白，采用Bradford法定量蛋白。將35 μg蛋白加入各孔中進行垂直電泳，卸膠、轉(zhuǎn)模，在封閉液中搖床封閉1 h。按照1∶1 000加入一抗稀釋液(SBP1抗體)，4 ℃過夜，室溫下加入TBST，搖床上清洗，10 min×3次；TBST漂洗后從一抗中取出膜，加入二抗，室溫下反應(yīng)1 h，加入TBST，搖床上清洗，10 min×3次。洗膜后加入ECL顯影劑，并用ImageJ軟件進行半定量灰度分析。

1.3 CD疾病指數(shù)評價

CD疾病指數(shù)(CDAI)主要從腹痛、腹部包塊、腹瀉、伴隨疾病這4個方面進行評價。CDAI評分≤4分為緩解期，>4分為活動期。CDAI評分5～7分為輕度活動期，8～16分為中度活動期，>16分為重度活動期。

1.4 隨訪

采用復(fù)診方式對CD患者進行隨訪，觀察患者出院后12個月內(nèi)的預(yù)后情況。本研究將復(fù)發(fā)、CD相關(guān)黏膜異常增生、CD相關(guān)結(jié)直腸癌定義為預(yù)后不良。隨訪起始時間為2016年8月27日，截止時間為2019年9月18日。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CD組與息肉組SBP1表達水平比較

CD組患者SBP1表達水平為20.32±4.37，高于息肉組(16.45±3.90)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.343，P<0.001)。

2.2 不同病變部位SBP1表達水平比較

CD患者回腸末端、結(jié)腸、回結(jié)腸中SBP1表達水平分別為21.08±4.45、20.14±4.35、19.48±4.27。不同病變部位SBP1表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.092，P=0.342)。

2.3 SBP1表達水平與CD患者炎性狀態(tài)的關(guān)系

按照CDAI評分將CD患者分為緩解期組(n=32)、輕度活動期組(n=23)、中度活動期組(n=18)、重度活動期組(n=22)，各組SBP1表達水平分別為16.53±4.20、19.02±4.30、21.72±4.36、26.30±4.42，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.740，P<0.001)，其中重度活動期組SBP1表達水平高于中度活動期組、輕度活動期組、緩解期組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。SBP1表達水平在緩解期組、輕度活動期組、中度活動期組、重度活動期組中呈逐漸升高趨勢，提示其與CDAI評分呈正相關(guān)(r=0.263，P=0.010)。見圖1。

2.4 CD患者預(yù)后不良組與預(yù)后良好組基本資料的比較

95例CD患者隨訪期間的預(yù)后不良發(fā)生率為45.26%(43/95)，其中復(fù)發(fā)35例(36.84%)，CD相關(guān)黏膜異常增生7例(7.37%)，CD相關(guān)結(jié)直腸癌1例(1.05%)。由表1可知，預(yù)后不良組與預(yù)后良好組在年齡、性別、BMI、吸煙、CRP、腸切除術(shù)史、腸梗阻、病變位置、治療方案、治療時間方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在肛周病變、ESR、疾病行為、SBP1方面比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 SBP1與CDAI的相關(guān)性散點圖

2.5 影響CD患者預(yù)后的因素

將肛周病變(無=0，有=1)、ESR、疾病行為(非狹窄非穿透、狹窄=0，穿透=1)、SBP1作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將CD患者預(yù)后情況(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)作為因變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示肛周病變、疾病行為及SBP1與CD患者的預(yù)后密切相關(guān)。見表2。

2.6 SBP1、模型A、模型B預(yù)測CD患者預(yù)后的效能

采用二元Logistic回歸方法建立肛周病變、疾病行為預(yù)測CD患者預(yù)后的模型：F=-0.598+0.580×肛周病變+0.780×疾病行為，將其命名為模型A；肛周病變、疾病行為、SBP1預(yù)測CD患者預(yù)后的模型：F=-6.848+0.645×肛周病變+0.268×疾病行為+0.331×SBP1，將其命名為模型B。SBP1預(yù)測CD患者預(yù)后的ROC曲線下面積(AUC)大于模型A(Z=3.005，P=0.003)，模型B預(yù)測CD患者預(yù)后的ROC AUC大于SBP1及模型A(Z=2.860，P=0.004；Z=5.595，P<0.001)。見表3、圖2。

表1 兩組基本資料比較

表2 影響CD患者預(yù)后的因素

表3 SBP1、模型A、模型B預(yù)測CD患者預(yù)后的效能

圖2 SBP1、模型A、模型B預(yù)測CD患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

多項研究認為CD的發(fā)生、發(fā)展與腸道菌群失調(diào)、免疫介導(dǎo)的組織損傷及遺傳易感性等相關(guān)[11-12]。CD隨疾病進展易發(fā)生多種并發(fā)癥，如腸梗阻、消化道穿孔等[13]。CD的炎性狀態(tài)可在一定程度上反映疾病進展情況，目前臨床上常用于評估CD炎性狀態(tài)的生物標志物有CRP、ESR及糞乳鐵蛋白等，三者均在CD中異常表達，但CRP易受炎性疾病影響，因此在評估CD炎性狀態(tài)時的特異度較低；而ESR與血液系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如貧血、心血管疾病等均可引起ESR表達水平發(fā)生變化；糞乳鐵蛋白診斷炎癥性腸病的特異度較好，但當CD合并其他并發(fā)癥如腸易激綜合征時，易影響糞乳鐵蛋白的表達水平，導(dǎo)致特異度下降[14-15]。SBP1是一種定位于細胞質(zhì)和細胞核的含硒原子的蛋白質(zhì)，可在體內(nèi)穩(wěn)定存在，且個體間差異較小，有研究表明SBP1在2, 4, 6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的CD小鼠中表達水平升高[16]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD患者SBP1表達水平高于息肉組，表明SBP1可能參與了CD的發(fā)生過程。CDAI是基于CD患者臨床癥狀、體征及并發(fā)癥等進行的評分，可在一定程度上反映CD的疾病活動度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SBP1與CDAI呈正相關(guān)，表明SBP1與CD患者的炎性狀態(tài)密切相關(guān)，提示SBP1可能參與CD的疾病進展，檢測SBP1的表達水平有助于了解CD患者的病情。CD患者的預(yù)后是目前臨床研究的熱點及難點，了解影響CD患者預(yù)后的因素有利于及時進行干預(yù)，從而延緩疾病進展。郝曉煒等[17]對64例CD患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)約有42.19%的患者預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)95例CD患者隨訪期間的預(yù)后不良發(fā)生率約為45.26%，與既往研究結(jié)果相近。為明確影響CD患者預(yù)后的因素，本研究采用Logistic回歸分析影響CD患者預(yù)后的因素，結(jié)果顯示肛周病變、疾病行為及SBP1與CD患者預(yù)后密切相關(guān)，其原因可能為以肛周病變?yōu)槭装l(fā)臨床表現(xiàn)的CD診斷較為困難，易被忽略，影響治療效果，導(dǎo)致預(yù)后較差[18]。穿透型CD患者腸道病變復(fù)雜，穿孔、出血等并發(fā)癥發(fā)生率較高，且穿透行為是CD患者接受腹部手術(shù)治療的首要原因，患者預(yù)后恢復(fù)較差[19]。為了評價SBP1預(yù)測CD患者預(yù)后的效能，本研究構(gòu)建了SBP1、模型A及模型B預(yù)測CD患者預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果顯示模型B預(yù)測CD患者預(yù)后的效能高于SBP1及模型A，表明SBP1有助于評估CD患者的預(yù)后情況。

谷胱甘肽的異常表達與CD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。谷胱甘肽是一種水溶性的三肽，由谷氨酸鹽、半胱氨酸和甘氨酸組成，其對于維持胃腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要作用。動物實驗表明，谷胱甘肽缺乏的小鼠空腸和結(jié)腸黏膜嚴重退化，并出現(xiàn)體質(zhì)量降低及腹瀉等癥狀[20]。此外，谷胱甘肽表達水平降低后，Th2型細胞免疫反應(yīng)占優(yōu)勢，病變部位分泌的白細胞介素-4、白細胞介素-10等炎性因子表達水平升高，而γ-干擾素表達水平降低，可對腸黏膜造成損傷，導(dǎo)致發(fā)生腸道炎性疾病[21]。另有研究表明，SBP1可調(diào)節(jié)谷胱甘肽的表達水平，并促進氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。由此推測，SBP1可能通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽的表達水平參與CD的疾病進展。

綜上所述，SBP1與CD患者的炎性狀態(tài)及預(yù)后關(guān)系密切，檢測SBP1表達水平有助于評估CD患者的預(yù)后情況。本研究下一步將動態(tài)監(jiān)測SBP1的表達水平并進行基礎(chǔ)研究，分析SBP1 影響CD患者預(yù)后的病理生理機制。