解靜聰， 蔣劍春， 高月淑， 徐 浩， 趙 劍， 衛(wèi) 民

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室；國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042)

半纖維素是廣泛分布于林草生物質(zhì)中的一類多糖，常以戊糖經(jīng)多種不同類型的糖苷鍵聚合而成[1]，其降解產(chǎn)物，如低聚木糖具有開(kāi)發(fā)成為高附加值保健品的潛力。低聚木糖主要是木糖經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接形成的聚合度2～10的寡糖，屬于功能性低聚糖,它對(duì)多種雙歧桿菌和乳桿菌等公認(rèn)的腸道益生菌顯示出選擇性增殖作用[2-3]。同時(shí)有研究[4]顯示，僅需口服0.7g低聚木糖，2周后即可改善人體腸道菌群分布情況，益生菌雙歧桿菌的比例可提高約一倍，與其他功能性低聚糖相比，是目前價(jià)效最高的低聚糖。此外，低聚木糖還顯示出降血壓[5]、降血脂和降血糖作用[6-7]。因其顯著的保健功能，近年來(lái)已被開(kāi)發(fā)成為新型的益生元和功能性低聚糖產(chǎn)品。酶法水解因條件溫和、綠色環(huán)保成為目前制備低聚糖的主要手段，也是目前研究的熱點(diǎn)。而傳統(tǒng)微生物發(fā)酵制低聚木糖存在木聚糖酶粗酶液中組分復(fù)雜，常含有β-木糖苷酶，其作用于低聚木糖的非還原性末端并釋放木糖[8]，不利于水解過(guò)程中低聚木糖積累，也極大地影響了低聚木糖的品質(zhì)。通過(guò)分離純化獲得低β-木糖苷酶含量的木聚糖酶[9-10]，或通過(guò)調(diào)控酶水解反應(yīng)條件降低β-木糖苷酶活力等手段[11]，雖然能夠減少低聚木糖的降解，但增加了制備成本。而通過(guò)無(wú)β-木糖苷酶活力的木聚糖酶基因工程菌制備組分單一的重組木聚糖酶，對(duì)木聚糖進(jìn)行定向水解獲得低聚木糖是一種可行的方案[12]。近年來(lái)，多種不同來(lái)源的木聚糖酶基因已成功在大腸桿菌、芽孢桿菌、釀酒酵母、里氏木霉和煙草為宿主的異源表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，為木聚糖酶在食品、飼料、造紙和醫(yī)藥等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。作者所在實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中構(gòu)建了來(lái)源于擬桿菌的木聚糖酶基因重組菌，本研究圍繞重組菌的誘導(dǎo)產(chǎn)酶條件，探討了木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖和楊木木聚糖的水解條件及得率的影響，以期為制備高純度低聚木糖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)獲得其水解木聚糖的酶解工藝參數(shù)及產(chǎn)物組分的分布規(guī)律。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑和設(shè)備

玉米芯木聚糖(半纖維素85.5%)通過(guò)堿性過(guò)氧化氫提取[13]；楊木木聚糖(半纖維素79.8%)是以楊木屑為原料，按料液比1 ∶20(g ∶mL)添加10%NaOH溶液，于90 ℃抽提4 h后精制獲得；櫸木木聚糖，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。胰蛋白胨及酵母提取物，美國(guó)Oxoid公司；氨芐青霉素(Amp)及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，上海生物工程公司。木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖，愛(ài)爾蘭Megazyme公司；其他試劑均為市售分析純。

HH-2數(shù)控水浴搖床，上海維誠(chéng)公司；Synergy HTX全波段讀板機(jī)，美國(guó)BioTek公司；Avanti JXN-30冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝公司。

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3) 及重組質(zhì)粒pTrc99A-podoxyn11，均由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所生物質(zhì)能源研究室保存。盧里亞·貝爾塔尼(LB)培養(yǎng)基： 1%胰蛋白胨，0.5% 酵母抽提物，1%NaCl。

1.2 重組木聚糖酶誘導(dǎo)條件的考察

1.2.1重組菌種子液培養(yǎng) 將重組質(zhì)粒pTrc99a-podoXyn11電擊轉(zhuǎn)化到宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)，涂布在氨芐青霉素質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)10 h，即為重組菌種子液。

1.2.2誘導(dǎo)表達(dá)條件的影響 在250 mL的三凹培養(yǎng)瓶中，LB培養(yǎng)基裝液量50 mL將種子液接種至培養(yǎng)瓶到適宜的菌體光密度(OD)值，通過(guò)OD值以及誘導(dǎo)溫度等因素，探討分別改變單因素誘導(dǎo)條件，對(duì)重組酶誘導(dǎo)表達(dá)的影響。所收集樣品在4 ℃ 條件下經(jīng)1 000 r/min 離心5 min后去除上清液，加入相同體積的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液(50 mmol/L，pH值6.5)并充分重懸菌體，經(jīng)超聲波破碎后，4 ℃ 條件下經(jīng)1 200 r/min離心20 min 即獲得重組木聚糖酶粗酶液，用于測(cè)定不同誘導(dǎo)條件下重組木聚糖酶的酶活力。

1.3 重組木聚糖酶活力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14-16]報(bào)道方法測(cè)定酶活力，反應(yīng)體系總體積為200 μL，其中包括10 μL的500 mmol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液，170 μL的1.5%木聚糖溶液，置于酶最適反應(yīng)溫度下孵育10 min后，向反應(yīng)體系中加入稀釋至適宜濃度的酶液20 μL，混勻后，孵育20 min。向離心管中加入300 μL DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min 后冰浴至室溫，在550 nm下讀取吸光度值。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，根據(jù)吸光度值換算出重組木聚糖酶水解底物后釋放的還原糖的量。

配置10 g/L 木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其稀釋不同倍數(shù)至木糖質(zhì)量濃度0.05～1.2 g/L，取200 μL不同質(zhì)量濃度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入300 μL DNS試劑，混勻后經(jīng)沸水浴10 min后冰浴至室溫，在550 nm下讀取吸光度值(A550)作為X值，對(duì)應(yīng)的木糖濃度(Cx)作為Y值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Cx=0.376 3A550-0.024。

將最適酶反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶的量定義為1個(gè)酶活力單位。

大數(shù)據(jù)是指具有5種特征的數(shù)據(jù)，包括數(shù)據(jù)量大(TB級(jí)以上)、數(shù)據(jù)快速產(chǎn)生和更新、數(shù)據(jù)類型多樣、數(shù)據(jù)來(lái)源于真實(shí)世界、數(shù)據(jù)價(jià)值高而價(jià)值密度低[2-4]。大數(shù)據(jù)分析是發(fā)現(xiàn)大數(shù)據(jù)的隱藏規(guī)律、潛在價(jià)值的方法，主要包括傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等[2-4]。大數(shù)據(jù)分析的主要流程包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)標(biāo)注、數(shù)據(jù)特征選擇、應(yīng)用算法建立數(shù)據(jù)分析模型、應(yīng)用數(shù)據(jù)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀⑦M(jìn)一步反饋優(yōu)化模型等[5]。

1.4 重組木聚糖酶的酶解性能

稱取木聚糖60 mg置于50 mL錐形瓶中，加入0.5 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液 (pH值5.5) 2 mL、重組木聚糖酶液及適量蒸餾水，定容至30 mL，再充分混勻后以硅膠塞塞緊瓶口，置于45 ℃水浴搖床中，150 r/min振蕩水解，所取樣品于10 000 r/min條件下離心10 min后，取上清液進(jìn)行相關(guān)組分的測(cè)定。

1.5 分析方法

木質(zhì)纖維素原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定按照 NREL標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行；水解液中總糖通過(guò)酸水解HPLC測(cè)定，在水解液中加入稀硫酸高溫水解后HPLC測(cè)定糖濃度；水解產(chǎn)物還原糖的測(cè)定采用DNS法[17]，水解產(chǎn)物中單糖含量的測(cè)定用HPLC法。HPLC測(cè)試條件為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)色譜柱，5 mmol/L的硫酸流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，柱溫為65 ℃。低聚木糖含量的測(cè)定選用高效離子色譜(Dionex ICS-5000)，色譜柱為CarbonPac PA200，流動(dòng)相為100 mmol/L NaOH和500 mmol/L NaAc，流速為0.3 mL/min，柱溫30 ℃。

酶解率和低聚木糖得率分別按照式(1)和式(2)計(jì)算：

A=(C×R)/C0×100%

(1)

B=(X2+X3+X4+X5+X6)/C0×100%

(2)

式中：A—酶解率，%；C—水解液總糖質(zhì)量濃度，g/L；C0—反應(yīng)前木聚糖質(zhì)量濃度,g/L；R—木聚糖與木糖之間的轉(zhuǎn)化系數(shù)，0.88；B—低聚木糖得率，%；X2～6—木二糖到木六糖的質(zhì)量濃度，g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)條件對(duì)重組木聚糖酶表達(dá)的影響

2.1.1誘導(dǎo)劑濃度 重組木聚糖酶基因的表達(dá)受trc啟動(dòng)子的調(diào)控，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是該種trc啟動(dòng)子的常用誘導(dǎo)劑，在較低濃度下即可不同程度地啟動(dòng)目的基因的表達(dá)。在適宜培養(yǎng)條件下，重組菌OD600值為1.0時(shí)，分別加入誘導(dǎo)劑至終濃度1、 2.5、 5、 10、 15和20 mmol/L，在28 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h后取樣測(cè)定單位體積菌液中木聚糖酶活力。誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組木聚糖酶的表達(dá)情況的影響如圖1(a)所示。在IPTG濃度達(dá)到5 mmol/L時(shí)，即可完全啟動(dòng)重組酶基因的表達(dá)，表現(xiàn)出最優(yōu)的誘導(dǎo)效果。當(dāng)濃度繼續(xù)升高時(shí)，酶活力反而略有降低，其可能原因是誘導(dǎo)劑本身對(duì)細(xì)胞具有一定毒性，其濃度過(guò)高會(huì)影響了菌體的正常生長(zhǎng)。

2.1.2誘導(dǎo)溫度 將誘導(dǎo)劑終濃度選擇為5 mmol/L，將誘導(dǎo)溫度分別設(shè)定為25、 28、 32、 35、 37和42 ℃，經(jīng)6 h培養(yǎng)后分別測(cè)定單位體積菌液的酶活力，結(jié)果如圖1(b)所示。在32 ℃條件下顯示出最佳誘導(dǎo)效果。當(dāng)誘導(dǎo)溫度過(guò)低時(shí)，不利于菌體量的積累，而誘導(dǎo)溫度過(guò)高時(shí)，目的蛋白翻譯速度過(guò)快，會(huì)影響目的蛋白的正確折疊，降低目的蛋白的可溶性表達(dá)。

2.1.3誘導(dǎo)菌體光密度值 待重組菌生長(zhǎng)至菌體光密度(OD600)為0.6、 1.0、 1.2、 1.6和2.2時(shí)，在最優(yōu)誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度下進(jìn)行重組木聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)，6 h后取樣，并測(cè)定單位體積菌液的酶活力，結(jié)果如圖1(c)所示。待重組菌生長(zhǎng)至OD600值達(dá)1.2時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，所獲得單位菌液的酶活力高于其他菌體濃度下誘導(dǎo)表達(dá)的效果。在低菌體濃度下添加誘導(dǎo)劑可能會(huì)影響菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中菌體量的積累。

2.1.4誘導(dǎo)時(shí)間 待重組菌生長(zhǎng)生至OD600為1.2時(shí)，添加誘導(dǎo)劑至終濃度5 mmol/L，于32 ℃下誘導(dǎo)不同時(shí)間后收集菌體，單位菌液的酶活力測(cè)定結(jié)果如圖1(d)所示。誘導(dǎo)8 h后，單位菌液的重組木聚糖酶活力最多可達(dá)5.72 U/mL。誘導(dǎo)時(shí)間是重組蛋白積累效率的直接影響因素，同時(shí)也與菌體生長(zhǎng)狀態(tài)相關(guān)，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短，重組木聚糖酶的積累量降低，產(chǎn)率隨著降低。而誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體在生長(zhǎng)狀態(tài)受到影響，菌體自溶及宿主內(nèi)源性蛋白酶的產(chǎn)生都會(huì)降低目的蛋白的積累，進(jìn)而影響酶活力。

a.誘導(dǎo)劑濃度inducer concentration;b.誘導(dǎo)溫度induction temperature;c.菌體光密度OD600 value;d.誘導(dǎo)時(shí)間induction time

2.2 重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖

2.2.1溫度和pH的影響 玉米芯是我國(guó)常見(jiàn)的一類農(nóng)林剩余物[18]，其中半纖維素含量較高，木質(zhì)素的含量較低，通過(guò)酶法定向水解玉米芯木聚糖制備低聚木糖是高值化利用有效方式。適宜的溫度和pH值條件是保證酶穩(wěn)定性的同時(shí)保持其較高的催化反應(yīng)活性的重要影響因素。在底物質(zhì)量濃度為20 g/L，酶添加量為10 U/g，酶水解12 h條件下，反應(yīng)溫度對(duì)重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖轉(zhuǎn)化率的影響如圖2(a)所示，在45 ℃下顯示出最高的酶解率。相同條件下，pH值對(duì)重組酶水解玉米芯木聚糖轉(zhuǎn)化率的影響如圖2(b)所示，在pH值 5.5條件下顯示出最高的酶解率。

2.2.2酶添加量的影響 酶添加量對(duì)酶水解的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物低聚木糖的積累具有顯著影響，在最適酶反應(yīng)條件下，不同重組酶添加量對(duì)20 g/L玉米芯木聚糖酶解得率的影響如圖3所示，隨著酶添加量的增加，酶解率呈逐漸升高的趨勢(shì)，當(dāng)酶添加量達(dá)60 U/g后，低聚糖的得率顯著提高。可能是當(dāng)酶添加量達(dá)到60 U/g后，酶蛋白與可接觸木聚糖的結(jié)合達(dá)到飽和，對(duì)木聚糖的水解速率趨于穩(wěn)定，而部分游離木聚糖酶對(duì)長(zhǎng)鏈木寡糖進(jìn)行降解，從而釋放更多的低聚木糖。因此，玉米芯木聚糖酶水解的最佳酶添加量為60 U/g。

圖2 溫度(a)和pH(b)對(duì)重組酶水解玉米芯木聚糖酶解率的影響

2.2.3酶解時(shí)間的影響 在酶最適反應(yīng)條件下(pH值5.5檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖，45 ℃)對(duì)20 g/L玉米芯木聚糖進(jìn)行酶水解，定時(shí)取樣，測(cè)定酶解率及產(chǎn)物低聚木糖的成分變化，繪制酶解反應(yīng)時(shí)效曲線。如圖4所示，最佳反應(yīng)時(shí)間為12 h，低聚木糖得率為21.75%，此后繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，低聚木糖得率基本維持不變。重組酶水解玉米芯木聚糖的酶解率為49.90%，但低聚木糖得率僅為21.75%，兩者具有顯著差異，這一點(diǎn)與歐陽(yáng)嘉等報(bào)道相似[12]。由于玉米芯木聚糖中L-阿拉伯糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高(19.32%)[13]，可能形成阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖以及木聚糖上的阿拉伯糖支鏈。因木聚糖酶不具備水解阿拉伯糖苷的能力，而無(wú)法將阿拉伯糖基的半纖維素降解為低聚糖。同時(shí)這類半纖維素增加了酶與底物間的無(wú)效結(jié)合，也在一定程度上影響了低聚木糖的得率。對(duì)產(chǎn)物成分的分析結(jié)果(見(jiàn)圖4)表明，在反應(yīng)初期，檢測(cè)到木二糖、木三糖、木四糖、木五糖以及木六糖，其中木四糖和木五糖含量略高于木二糖和木三糖，并隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為木二糖和木三糖。至反應(yīng)結(jié)束時(shí)，產(chǎn)物中主要成分為木二糖(2.64 g/L)和木三糖(1.73 g/L)，幾乎不含木糖。

圖3 酶添加量對(duì)玉米芯木聚糖酶解率的影響

2.3 重組木聚糖酶水解楊木木聚糖

2.3.1溫度和pH的影響 楊樹(shù)是我國(guó)種植較為廣泛的一種用材林，在多種方面具有廣闊的應(yīng)用[19-20]，其加工后剩余的鋸屑和木渣是一類亟待高效利用的林業(yè)剩余物。楊木中半纖維素含量較高，且主要成分以木聚糖為主，是制備低聚木糖的優(yōu)質(zhì)原料[21]。針對(duì)20 g/L的不同底物，當(dāng)酶添加量均為10 U/g 并反應(yīng)12 h后，重組木聚糖酶顯示出與水解玉米芯木聚糖相同的最適酶解溫度和最適酶解pH值，結(jié)果如圖5所示。但在相同的底物濃度、酶用量、溫度和pH值條件下，重組酶對(duì)楊木木聚糖的酶解效率顯著高于其對(duì)玉米芯木聚糖的酶解效率。

圖5 溫度(a)和pH值(b)對(duì)重組酶水解楊木木聚糖酶解率的影響

2.3.2酶添加量和酶解時(shí)間的影響 在20 g/L楊木木聚糖濃度和最適酶解條件下，酶添加量的優(yōu)化的結(jié)果如圖6所示，當(dāng)重組酶添加量為35 U/g時(shí)，顯示出較高的酶解效率，同時(shí)低聚木糖得率也隨著酶添加量的增加逐漸提高。在酶最適反應(yīng)條件下(pH值5.5檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖，45 ℃)添加重組木聚糖酶至35 U/g，進(jìn)行酶水解并定時(shí)取樣，繪制酶解反應(yīng)時(shí)效曲線，結(jié)果如圖7所示。與水解玉米芯木聚糖規(guī)律相似，該條件下最佳反應(yīng)時(shí)間為14 h，酶解率為79.50%，繼續(xù)延長(zhǎng)酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶水解得率無(wú)顯著地提高，同時(shí)低聚木糖得率在反應(yīng)14 h后達(dá)到最高，約為73.30%。對(duì)產(chǎn)物成分的分析顯示，與玉米芯木聚糖酶水解產(chǎn)物的變化規(guī)律有所差別，楊木木聚糖在水解3 h后，其水解產(chǎn)物中木二糖和木三糖的含量略高于木四糖和木五糖。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，木四糖和木五糖無(wú)顯著積累，而木二糖和木三糖的含量逐漸提高至反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，木二糖(10.56 g/L)和木三糖(4.09 g/L)為低聚木糖的主要成分，除微量木四糖(0.01 g/L)外，幾乎不產(chǎn)生木糖。

圖6 酶添加量對(duì)楊木木聚糖酶解率的影響

3 結(jié) 論

3.1重組木聚糖酶的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)劑濃度為5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度32 ℃，誘導(dǎo)OD600值為1.2，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，此時(shí)重組酶酶活力可達(dá)5.72 U/mL。

3.2重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖的最佳條件為：溫度45 ℃，pH值5.5，加酶量為60 U/g，反應(yīng)12 h，該條件下酶解率為49.9%，低聚木糖得率為21.75%，產(chǎn)物中木二糖質(zhì)量濃度為2.64 g/L，木三糖質(zhì)量濃度為1.73 g/L，幾乎不含木糖。

3.3重組木聚糖酶水解楊木木聚糖的最佳條件為：溫度45 ℃，pH值5.5，加酶量為35 U/g，反應(yīng)14 h，該條件下酶解率為79.50%，低聚木糖得率為73.30%，產(chǎn)物主要為木二糖(10.56 g/L)和木三糖(4.09 g/L)，及少量木四糖外幾乎不產(chǎn)生木糖。